IL-2对布鲁菌侵染小鼠巨噬细胞释放细胞因子及吞噬能力的调节作用

齐江姣，罗 成，李村院，王元元，周光普，谭 君，高剑峰

(石河子大学生命科学学院细胞分子生物学实验室，新疆石河子 832003)

白介素2(IL-2)是一种调控免疫应答的重要因子[1]，它具有多向性作用(主要是对淋巴细胞生长、增殖、分化的促进)，对机体的免疫应答和抗病菌、病毒等有重要作用，能活化T 细胞，促进细胞因子产生，刺激自然杀伤细胞(NK细胞)增殖，提高NK细胞杀伤活性及产生细胞因子[2]，淋巴因子激活的杀伤细胞(LAK细胞)的诱导产生；促进B细胞增殖和分泌抗体；具有广泛的生物活性(激活巨噬细胞，参与抗体反应、造血和肿瘤监视)。单核-巨噬细胞受到IL-2 的持续作用后，其抗原递呈能力、杀菌力、细胞毒性均明显增强，分泌某些细胞因子的能力也得到加强[3]。

研究发现，IL-2对于一些疾病的治疗或癌症细胞的作用已取得了一系列的成果[4-6]。Roviello G等[7]研究结果表明，IL-2对黑色素瘤或肾以外的实体肿瘤有重要作用。Abhishek K等[8]详细阐述了IL-2与登革热严重程度的关系，结果表明IL-2对登革热治疗有重要的作用。熊一全等[9]就IL-2增强淋巴细胞对乳腺癌细胞的杀伤作用研究，表明IL-2能促进淋巴细胞对MCF-7的杀伤作用。但对于IL-2在布鲁菌病(简称布病)炎症反应中的作用尚不清楚，由于布病是一种世界范围内流行的高度接触性人畜共患病，会导致不孕不育及流产等症状，给人类的健康和畜牧业的发展造成巨大的威胁[10]，故研究IL-2对被M5株侵染的巨噬细胞(MΦ)所释放的细胞因子(TNF-α、IFN-γ和NO)及吞噬能力的调节作用具有重要的意义[11]。本文就巨噬细胞本身TNF-α、NO和IFN-γ的含量[12]以及在IL-2对M5侵染的腹腔巨噬细胞对上述细胞因子释放量进行比较，以此探讨IL-2对布病反应的调节作用，为布病的治疗提供新的理论依据。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 实验动物与菌种 昆明小鼠，18 g～22 g,由石河子大学实验动物中心所提供；布鲁菌的菌种(M5)，由石河子大学生命科学学院细胞分子生物学实验室保存。

1.1.2 主要试剂 IL-2 ，Cyagen 生物公司产品；TNF-α、NO、IFN-γ酶联免疫吸附试验(ELISA) 试剂盒，美国Biosource公司产品；DMEM 培养基，美国Gibco 公司产品；胎牛血清，Hyclone 公司产品；台盼蓝染色液，北京中生瑞泰科技有限公司产品。

1.1.3 仪器设备 高压蒸汽自动灭菌锅，Hirayama公司产品；CO2培养箱、-80℃超低温冰箱，Thermo公司产品；恒温水浴槽，北京长安科学仪器厂生产；高速低温离心机，Beckman公司产品；611UF纯水仪，Bioteck公司产品。

1.2 方法

1.2.1 腹腔巨噬细胞的收集和纯化 小鼠腹腔注射20 g/L无菌淀粉溶液，每只1.5 mL，24 h后颈椎脱位法处死小鼠，将小鼠浸泡在750 mL/L酒精中5 min进行消毒后，取出小鼠，用无菌的滤纸吸干酒精，用5 mL注射器往腹腔注射5 mL无菌PBS(37℃提前温浴)，轻揉腹壁，无菌操作取腹腔液，1 500 r/min离心5 min，洗涤2次后，用不含抗生素的完全DMEM Basic(1×) 培养液(含100 mL/L BSA)悬浮细胞，并置于培养瓶中培养过夜。第2天，用PBS彻底冲洗去除未贴壁细胞，台盼蓝染色检测细胞存活率，用不含抗生素的完全DMEM Basic(1×) 培养液调整细胞浓度为2×105cells/mL，备用。

1.2.2 布鲁菌刺激后细胞因子释放的时效关系 试验组分为阴性对照组(正常细胞)和侵染组(M5侵染)，用麦氏比浊管法调整菌液浓度，按100∶1的比例用M5侵染MΦ，将其置于37℃、体积分数为5% CO2的细胞培养箱中培养，分别在培养0、2、6、12、24 h时，收集各时间点的细胞培养上清液10 μL，然后用ELISA试剂盒测定TNF-α、NO 和IFN-γ的浓度大小。

1.2.3 IL-2作用下巨噬细胞吞噬M5的能力 试验组分为阴性对照组(正常细胞)、空白对照组(M5 侵染)、不同浓度IL-2调节组(IL-2+M5侵染)，用麦氏比浊管法调整菌液浓度，按100∶1的比例在6孔板中用M5 侵染MΦ，分别加入0、1×106、3×106、5×106UI的IL-2，将其置于37℃、体积分数为5% CO2的细胞培养箱中培养，分别培养0、2、6、12、24 h。取各试验组的MΦ，计数，调整细胞浓度为2×106cells/mL，加入1 mL的裂解液，吸取10 μL,稀释103倍，利用CFU涂布计数法，取1 mL(2 000个细胞)均匀涂布于TSA固体培养基上培养，72 h后观察集落形成情况，计算吞噬指数；

吞噬指数=(2 000个MΦ吞菌总数/2 000个MΦ)×100%

1.2.4 IL-2作用M5侵染的巨噬细胞的细胞因子释放的时效关系 试验组分为阴性对照组(正常细胞)、空白对照组(M5 侵染)、不同浓度IL-2调节组(IL-2+M5侵染)，用麦氏比浊管法调整菌液浓度，按100∶1的比例在6孔板中用M5侵染MΦ，分别加入0、1×106、3×106、5×106UI的IL-2，将其置于37℃、体积分数为5%CO2的细胞培养箱中培养，分别在培养0、2、6、12、24 h时，收集细胞培养上清液10 μL，然后用ELISA试剂盒测定TNF-α、NO 和IFN-γ的浓度大小。

2 结果

2.1 布鲁菌M5侵染巨噬细胞后释放各细胞因子的时效关系

为了排除培养液(主要是血清中)中的干扰，故设阴性对照组，表1中皆是减去阴性对照所得数据。布鲁菌M5侵染巨噬细胞后，释放了TNF-α、IFN-γ、NO等因子，M5刺激后2 h，TNF-α升高，6 h达到峰值12.360 ng/L±1.202 ng/L，与M5刺激0 h比较，呈极显著差异(P<0.01)；M5侵染24 h时，IFN-γ达到峰值24.524 ng/L±0.621 ng/L(P<0.01)；在M5侵染2 h时，NO含量持续升高，且在12 h时达到峰值6.424 ng/L±0.545 ng/L(P<0.01)。

表1 腹腔巨噬细胞(MΦ)被布鲁菌M5侵染后释放细胞因子的时效关系

注：同列数据肩标相邻大写字母表示差异显著(P<0.05),肩标相间大写字母表示差异极显著(P<0.01),肩标相同大写字母或无字母标注表示差异不显著(P>0.05)。

Note:In the same column, values with adjacent capital letters mean significant difference (P< 0.05),with alternate capital letters mean extremely significant difference (P< 0.01),and with the same or no letters mean no significant difference (P> 0.05).

2.2 IL-2作用下巨噬细胞胞内活菌数

由表2可知，布鲁菌M5侵染细胞0 h时，在各不同含量组IL-2作用下，与对照组0IU相比，吞噬指数均无显著差异(P>0.05)；但在2、6、12、24 h时，不同含量IL-2作用下，吞噬指数均呈显著差异(P<0.05)。

相同IL-2含量条件下，各培养不同时间的MΦ，与对照组0 h相比，吞噬指数均呈极显著差异(P<0.01)；在2 h，IL-2含量为5×106IU时，吞噬指数达到最大值，高于相邻两组，极显著高于对照组(P<0.01)。表明IL-2的免疫调节功能具有双向性；对巨噬细胞的吞菌能力有明显的促进作用，并存在浓度和时间上的依赖性。

2.3 IL-2对布鲁菌侵染腹腔巨噬细胞后释放TNF-α的时效关系

由表3可知，在0、6、24 h时，在不同含量组IL-2作用下，与对照组0IU相比，均无显著差异(P>0.05)；在2 h和12 h时，MΦ 分泌的TNF-α 因子随着IL-2含量的增加为增长，且当IL-2含量为5×106IU 时，均显著高于对照组0 h的含量(P<0.05)，尤以2 h，IL-2 含量为5×106IU条件下，细胞释放TNF-α的效果达到最佳(P<0.01)。表明IL-2可以促进MΦ增殖或者活化，使其分泌TNF-α作用增强，并存在含量依赖性。

当IL-2含量为1×106IU和3×106IU 时，培养24 h时，血清中TNF-α 的含量显著高于对照组0 h的含量(P<0.01)，且以含量为1×106IU时，血清中TNF-α含量最大；当IL-2含量为5×106IU 时，培养2 h和12 h的MΦ释放TNF-α因子的含量均极显著高于对照组(P<0.01)，且培养2 h的释放量最大，效果最佳，极显著高于相邻两组(P<0.01)。表明了IL-2能使MΦ 活化，促进MΦ 分泌TNF-α，启动机体免疫应答，并存在着双向调节性和时间依赖性。

表2 IL-2对被M5侵染的巨噬细胞的吞噬能力的调节作用

注：①同行数据肩标相邻小写字母表示差异显著(P<0.05),肩标相间小写字母表示差异极显著(P<0.01),肩标相同小写字母或无字母标注表示差异不显著(P>0.05);② 同列数据肩标相邻大写字母表示差异显著(P<0.05),肩标相间大写字母表示差异极显著(P<0.01)，肩标相同大写字母或无字母标注表示差异不显著(P>0.05)。

Note：① In the same row, values with adjacent small letters mean significant difference (P< 0.05),with alternate small letters mean extremely significant difference (P< 0.01),and with the same or no letters mean no significant difference (P> 0.05);② In the same column, values with adjacent capital letters mean significant difference (P< 0.05),with alternate capital letters mean extremely significant difference (P< 0.01),and with the same or no letters mean no significant difference (P> 0.05).

表3 IL-2调节作用下被M5侵染的腹腔巨噬细胞释放TNF-α的时效关系

注：①同行数据肩标相邻小写字母表示差异显著(P<0.05)，肩标相间小写字母表示差异极显著(P<0.01)，肩标相同小写字母或无字母标注表示差异不显著(P>0.05)；②同列数据肩标相邻大写字母表示差异显著(P<0.05)，肩标相间大写字母表示差异极显著(P<0.01)，肩标相同大写字母或无字母标注表示差异不显著(P>0.05)。

Note：① In the same row, values with adjacent small letters mean significant difference (P< 0.05),with alternate small letters mean extremely significant difference (P< 0.01),and with the same or no letters mean no significant difference (P> 0.05);② In the same column, values with adjacent capital letters mean significant difference (P< 0.05),with alternate capital letters mean extremely significant difference (P< 0.01),and with the same or no letters mean no significant difference (P> 0.05).

2.4 IL-2对布鲁菌侵染腹腔巨噬细胞后释放IFN-γ 的时效关系

由表4可知，在2 h和24 h时，在各不同含量组IL-2作用下，与对照组0 IU相比，均无显著差异(P>0.05)；IL-2含量为3×106IU和5×106IU时，MΦ分别培养2 h、6 h所释放的IFN-γ均显著高于对照组(P<0.05)，尤以6 h，IL-2 含量为3×106IU条件下，细胞释放IFN-γ 的效果达到最佳(P<0.01)。结果显示IL-2对于IFN-γ 的释放有明显的促进作用，一定程度上可以增强机体的免疫应答能力。

同一含量IL-2条件下，培养2 h后，血清中MΦ 释放IFN-γ的含量均显著高于对照组0 h的含量(P<0.05)；培养24 h，血清中IFN-γ的含量与对照组相比，均呈极显著差异(P<0.01)；相同含量组条件下，IFN-γ的含量随着时间点的变化而变化，尤以24 h，IL-2含量为1×106IU时，IFN-γ的含量极显著高于对照组0 h的含量，达到最大值，MΦ 释放IFN-γ的能力在IL-2的作用下有所提高，并存在着时间依赖性。

表4 IL-2调节作用下被M5侵染的腹腔巨噬细胞释放IFN-γ的时效关系

注：①同行数据肩标相邻小写字母表示差异显著(P<0.05)，肩标相间小写字母表示差异极显著(P<0.01)，肩标相同小写字母或无字母标注表示差异不显著(P>0.05)；②同列数据肩标相邻大写字母表示差异显著(P<0.05)，肩标相间大写字母表示差异极显著(P<0.01)，肩标相同大写字母或无字母标注表示差异不显著(P>0.05)。

Note：① In the same row, values with adjacent small letters mean significant difference (P< 0.05),with alternate small letters mean extremely significant difference (P< 0.01),and with the same or no letters mean no significant difference (P> 0.05);② In the same column, values with adjacent capital letters mean significant difference (P< 0.05),with alternate capital letters mean extremely significant difference (P< 0.01),and with the same or no letters mean no significant difference (P> 0.05).

2.5 IL-2对布鲁菌侵染腹腔巨噬细胞后释放NO的时效关系

由表5可知，MΦ被M5侵染0 h时，各不同含量组IL-2作用下，血清中NO含量与对照组0 IU相比，均无显著差异(P>0.05)；含量组为1×106IU和5×106IU时，分别培养6、12、24 h后，血清中NO含量显著高于对照组0 IU含量(P<0.05)；且在IL-2含量为5×106IU，培养12 h血清中NO含量达到最大，MΦ的免疫应答能力达到最佳。

IL-2含量组为1×106IU和5×106IU时，血清中NO含量随着培养时间的增长而增加，且在培养12 h时MΦ 分泌NO的含量显著高于对照组0 h的含量(P<0.05)，达到峰值，高于相邻的2个时间点。结果说明在IL-2作用下，MΦ 分泌NO的的能力具有双向调节性，并存在时间依赖性。

表5 IL-2调节作用下被M5侵染的腹腔巨噬细胞释放NO的时效关系

注：①同行数据肩标相邻小写字母表示差异显著(P<0.05),肩标相间小写字母表示差异极显著(P<0.01),肩标相同小写字母或无字母标注表示差异不显著(P>0.05);②同列数据肩标相邻大写字母表示差异显著(P<0.05),肩标相间大写字母表示差异极显著(P<0.01),肩标相同大写字母或无字母标注表示差异不显著(P>0.05)。

Note：① In the same row, values with adjacent small letters mean significant difference (P< 0.05),with alternate small letters mean extremely significant difference (P< 0.01),and with the same or no letters mean no significant difference (P> 0.05);② In the same column, values with adjacent capital letters mean significant difference (P< 0.05),with alternate capital letters mean extremely significant difference (P< 0.01),and with the same or no letters mean no significant difference (P> 0.05).

3 讨论

巨噬细胞是炎症反应过程中的关键免疫细胞，不同炎症反应阶段，巨噬细胞发挥不同甚至相反的功能。本研究中采用不同含量IL-2在不同时间点作用巨噬细胞，发现随着IL-2含量的增加，巨噬细胞的吞噬能力在不断增加[13]，且IL-2含量越大，吞噬M5的能力越强，表明IL-2在一定程度上对巨噬细胞的吞噬能力有促进作用。在时间点上虽然也存在一定的依赖性，但胞内活菌数呈现一定的“波浪式”规律，大胆猜想认为IL-2对巨噬细胞的增殖或凋亡能力也有一定的影响，有待于进一步研究。

TNF-α是一个具有多重功能的细胞因子，具有免疫调节作用[14]，在炎症反应、机体防御中起着关键的作用。TNF在肿瘤作用方面有利有弊：①TNF是一个内源性的肿瘤促进因素，它可以刺激肿瘤细胞生长[15]，增殖，侵袭，转移，血管生成；②TNF又有杀肿瘤细胞的作用。活化后的MΦ能分泌大量的趋化因子和炎症因子，参与机体固有和获得性免疫调节。近年来的一些研究表明，近百种的活性物质被活化的MΦ产生，如TNF-α、NO等，其中许多与免疫应答及炎症有关[16]。TNF-α的出现能诱发机体代谢和血流动力学明显变化，促进炎症介质生成。IFN是一种广谱抗病毒剂，但它并不直接作用病毒，使细胞产生抗病毒蛋白，主要是通过细胞表面受体作用，以此增强巨噬细胞的活力，起到免疫调节作用[17-18]。IFN是一组有多种功能的活性蛋白质(主要是糖蛋白)，它们在同种细胞上具有广谱的抗病毒、影响细胞生长，以及分化、调节免疫功能等多种生物活性[19]。有研究发现IFN-γ可显著增强MΦ FcγR表达，以此提高MΦ的吞噬能力。另有资料表明单独用IFN-γ刺激MΦ时，在一定剂量范围内可使MΦ由静止态转变为应答态，成为致敏性的MΦ，然后在脂多糖或某些细胞因子作用下转变为活化的MΦ。NO能够降低疼痛和一些炎症反应，具有很强的抗炎作用。NO主要由NO合酶(NOS)催化产生，诱生型NO合酶存在MΦ内，在受到抗原或LPS等激活时，MΦ产生IL-1、TNF-α等因子[20]，以自分泌或旁分泌方式协同LPS诱导MΦ中iNOS的表达；Erdogan等研究发现大鼠布鲁菌感染模型中，肝脏和脾脏中NO浓度显著升高，而血浆中并不发生显著变化。

通过本试验数据分析发现，在IL-2浓度组为5×106IU作用下，MΦ被M5侵染2 h时，血清中TNF-α的含量达到最大值，大大提高了巨噬细胞的免疫应答作用，表明了IL-2能够促进MΦ活化，加强其分泌因子的能力，且存在着时间和浓度上的依赖性，还能够启动炎症反应的发生。在IL-2的调节作用下，血清中IFN-γ的含量无论从时间上还是IL-2浓度上，都可以看出，与对照组相比有显著性的增加，从另一方面也证明了IL-2可以增强MΦ的免疫作用；但是这个显著性的增加并没呈现严格规律性，可能与一些其他因子的影响有关，如IL-6，有待于进一步的探讨研究；在IL-2作用下，血清中NO含量存在差异性，但这种差异性并不是很大，即在一定程度上IL-2可以促进MΦ的活化，对NO的产生的作用是有限的，对机体免疫力的提高并没有所期望的效果。

本研究结果表明，IL-2可以促进MΦ活化,刺激MΦ使其分泌TNF-α、NO、IFN-γ的能力增强，参与抗布鲁菌的免疫应答，从而为临床运用IL-2研究及治疗布病提供新的思路和理论依据。IL-2能在一定程度上增强巨噬细胞的吞噬能力，存在着含量依赖性，且在含量和时间点亦具有双向调节性，含量过高时反而有一定程度的抑制作用，可能是由于IL-2对巨噬细胞的增殖或凋亡能力也有一定的影响，有待于进一步研究。

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