啤酒糟制备低聚木糖饲料添加剂预处理条件研究

邓元元，胡 超，朱文娟，陈思宇，兰时乐

（湖南农业大学生物科学技术学院，湖南长沙 410128）

啤酒糟是啤酒工业中的主要副产物，富含蛋白质、氨基酸、碳水化合物、微量元素等营养物质（王金华，2002）。由于啤酒糟水分含量高，极易腐败变质和造成环境污染，同时，啤酒糟中还含有大量的纤维素和半纤维素，制约了啤酒糟在饲料工业中的广泛应用。目前，国内外对啤酒糟的研究主要集中在饲料（Belibasakis，1996）、食用菌栽培原料（叶春苗，2015；朱斌，1996）、饲用酶制剂生产（宾冬梅，2015；杜晓梅，2012） 、鱼饲料 （张健，2011）、生产蛋白质饲料（王晓力，2016；蔡国林，2015）等领域。低聚木糖是一种具有独特生理活性的功能性低聚糖，其除了具有低热、稳定、耐酸、安全等良好的理化特性外，还具有提高机体免疫作用（Ayyappan Appukuttan Aachary，2011）、抗肿瘤、促进钙吸收、降低血脂血压以及显著增殖双歧杆菌和抑菌的功能（Yang，2012；韩玉洁，2006；尤新，2004；郑建仙，2004），因此，低聚木糖已广泛应用于食品工业、医药工业、饲料工业和农业领域等。

我国是一个啤酒生产和消费大国，据报道，每生产100 L啤酒大约产生20 kg啤酒糟（Mussatto，2006）。目前，大部分啤酒糟被用作粗饲料直接饲喂动物，经济效益低下，且啤酒糟中纤维素和半纤维素含量较高，影响动物的消化性和适口性。本文利用碳酸钠能使纤维素膨胀和双氧水的氧化作用对啤酒糟进行预处理，研究啤酒糟的预处理工艺，为进一步生产富含低聚木糖的啤酒糟饲料添加剂提供参考。

1 材料与方法

1.1 主要试剂 木二糖标准品（纯度98%），木三糖标准品（纯度98%），木四糖标准品（纯度97%），木五标准品（纯度96%），购于青岛博智汇力生物科技有限公司；碳酸钠、双氧水、氢氧化钙、氢氧化钠、盐酸、无水乙醇（AR，国药集团化学试剂有限公司）；乙腈（色谱纯，美国，Merck 公司）；高纯氮（纯度99%，长沙高科技气体有限公司）；纤维素酶、木聚糖酶和甘露聚糖酶均由湖南利尔康生物股份有限公司提供。其中纤维素酶10000 U/g，木聚糖酶100000 U/g，甘露聚糖酶8000 U/g。

1.2 主要仪器 色谱柱：COSMOSIL Sugar-D糖分析柱（250 mm×4.6 mm，5 μm，北京英莱克科技发展有限公司）；高效液相色谱仪（Agilent 1260，美国，WATERS）；蒸发光散色检测器 （ELSD，美国，WATERS）；电子分析天平（KF3102，浙江凯丰集团有限公司）；高速冷冻离心机（CR21G，无锡凯派克斯科技有限公司）。

1.3 试验方法

1.3.1 啤酒糟干燥和粉碎 将新鲜啤酒糟置于80℃恒温条件下烘干至恒重，用粉碎机粉碎至60～80目。

1.3.2 啤酒糟预处理条件的研究 啤酒糟物理预处理方法的筛选：准确称取10.00 g啤酒糟粉于200 mL烧杯中，按固∶水＝1∶5加入超纯水，搅拌均匀。分别置于110℃、微波、超声波条件下处理30 min，酶解并干燥后，测定低聚木糖的含量。考察不同物理预处理方法对低聚木糖产量的影响。

啤酒糟化学预处理方法的筛选：准确称取10.00 g啤酒糟粉于200 mL烧杯中，按固∶水＝1∶5加入超纯水，搅拌均匀。分别加入质量分数为1%的盐酸、氢氧化钠、氢氧化钙、碳酸钠以及碳酸钠（1%）+双氧水（0.3%），110 ℃条件下处理 30 min，酶解并干燥后，测定低聚木糖的含量。考察不同化学预处理方法对低聚木糖产量的影响。

碳酸钠和双氧水不同添加量的筛选：分别改变碳酸钠和双氧水的添加量，其他条件不变，110℃条件下处理30 min，酶解并干燥后，测定低聚木糖的含量。考察不同碳酸钠和双氧水添加量对低聚木糖产量的影响。

固水比的筛选：分别改变啤酒糟的固水比，其他条件不变，酶解并干燥后，测定低聚木糖的含量。考察固水比对低聚木糖产量的影响。

预处理温度的筛选：将啤酒糟分别置于90、95、100、105、110 ℃和 115 ℃条件下处理 30 min，其他条件不变，酶解并干燥后，测定低聚木糖的含量。考察不同预处理温度对低聚木糖产量的影响。

预处理时间的筛选：将啤酒糟分别预处理15、20、25、30、35 min，其他条件不变，酶解并干燥后，测定低聚木糖的含量。考察不同预处理时间对低聚木糖产量的影响。

1.3.3 啤酒糟的酶解及低聚木糖粗提 准确称取经过预处理并干燥后的啤酒糟粉5.00 g于100 mL烧杯中，按固∶水＝1∶3加入超纯水，同时按固体干重加入200 U/g的木聚糖酶，搅拌均匀后，于50℃条件下酶解4 h。加入啤酒糟粉10倍质量体积比的超纯水，30℃，150 r/min条件下提取30 min，然后在4000 r/min，4℃条件下离心15 min，收集上清液并定容至100 mL，4℃低温保存。

1.3.4 啤酒糟预处理条件优化 根据预处理单因素试验结果，选择对低聚木糖含量影响较大的预处理因素碳酸钠添加量、固水比、处理温度和处理时间进行四因素三水平正交优化。正交试验L9（34）设计见表 1。

表1 正交试验设计表

1.3.5 低聚木糖含量测定 色谱柱：COSMOSIL Sugar-D 糖分析柱（250mm×4.6mm，5 μm）；流动相为乙腈-水（69：31，V/V）；流速：0.9 mL/min；柱温：40℃；进样体积：3μL；蒸发温度：78℃；载气流速：1.6 L/min；载气压力：0.5 MP。

2 结果与分析

2.1 啤酒糟物理预处理方法对低聚木糖产量的影响 由图1可知，啤酒糟不同的预处理方式对低聚木糖产量的影响较大。当以110℃预处理啤酒糟后酶解产物中低聚木糖产量最大，为7.9441 mg/g，微波和超声波预处理啤酒糟后酶解产物中低聚木糖产量差异不大。因此，选择110℃作为预处理条件。

2.1.1 啤酒糟化学预处理剂对低聚木糖产量的影响 试验结果见图2。由图2可以看出，相同浓度下，不同的化学预处理剂对低聚木糖产量的影响较大。当以碳酸钠和双氧水联合预处理啤酒糟时，酶解物中低聚木糖的产量最大，达8.5802 mg/g。

2.1.2 碳酸钠和双氧水不同添加量对低聚木糖产量的影响 固定碳酸钠添加量为0.5%（m/m），分别加入不同质量体积分数的双氧水 （0.05%、0.1%、0.15%、0.2%和0.25%），其他条件不变，测定低聚木糖的产量。结果见图3。

图1 不同物理预处理方式对低聚木糖产量的影响

图2 化学预处理剂对低聚木糖产量的影响

图3 双氧水添加量对低聚木糖产量的影响

由图3可知，当双氧水添加量为0.1%时，低聚木糖产量最高，为10.2509 mg/g。但随着双氧水添加量的增加，低聚木糖产量明显下降并趋于稳定。双氧水作为一种强氧化剂，在一定浓度范围内能有效破坏纤维素和木质素的结晶结构，增加半纤维素的溶解能力，提高木聚糖酶对半纤维素的可及性，但浓度太高，可能抑制了双氧水对纤维素和木质素交联结构的破坏，从而降低了低聚木糖的产生。

选择双氧水添加量为0.1%，分别加入不同质量分 数的碳酸钠 （0.3%、0.5%、0.7%、0.9和1.1%），其他条件不变，测定低聚木糖的产量。结果见图4。

图4 碳酸钠添加量对低聚木糖产量的影响

从图4可以看出，在一定范围内，随着碳酸钠添加量的增加，低聚木糖产量也随之增加，当碳酸钠添加量为0.7%时，低聚木糖产量达到13.9043 mg/g，但碳酸钠添加量超过0.7%，低聚木糖产量下降。

2.1.3 固水比对低聚木糖产量的影响 在上述试验结果基础上，分别调节啤酒糟的固液比为1∶3、1∶4、1∶5、1∶6、1∶7 和 1∶8，其他条件不变，测定低聚木糖的产量。结果见图5。

图5 固水比对低聚木糖产量的影响

由图5可知，随着固液比增加，低聚木糖产量随之增加。当固液比为1∶6时，低聚木糖的产量达14.4384 mg/g，但固液比继续增加，低聚木糖产量下降。

2.1.4 预处理温度对低聚木糖产量的影响 温度是影响纤维素和木质素降解的主要因素之一，在一定温度范围内，随着温度的升高，纤维素和木质素的水解反应和热解反应加快，但处理温度过高，水解产物容易发生缩合反应，从而降低半纤维素的溶出率，影响低聚木糖的产生。图6结果表明，预处理温度为110℃时，低聚木糖产量最高，为17.1814 mg/g。当温度超过110℃时，随着预处理温度的升高，低聚木糖产量反而下降。

图6 预处理温度对低聚木糖产量的而影响

2.1.5 预处理时间对低聚木糖产量的影响 在上述试验结果基础上，将啤酒糟分别处理15、20、25、30、35 min，其他条件不变，测定低聚木糖的产量。结果见图7。

图7 预处理时间对低聚木糖产量的影响

图7结果表明，随着预处理时间的延长，低聚木糖的产量呈先增大后降低的趋势。当预处理时间为30 min时，低聚木糖产量为16.4982 mg/g，但预处理时间超过30 min，低聚木糖产量下降。原因可能是预处理时间过长，啤酒糟中的半纤维素被水解为木糖、甘露糖以及阿拉伯糖等，从而降低低聚木糖的产量。

2.2 啤酒糟预处理条件优化 由表2可以看出，啤酒糟预处理后低聚木糖产量适宜的组合为A3B1C3D2，即 Na2CO30.7%，固液比为 1∶5，预处理温度为115℃，预处理时间为30 min时，低聚木糖含量为19.4693 mg/g。从极差分析可知，在所选取的试验条件下，影响低聚木糖产量的主次顺序为：温度＞时间＞碳酸钠浓度＞固水比，对低聚木糖产量影响最大的因素为预处理温度，其次为预处理时间，影响最小的是固水比。

表2 正交试验结果

3 结论

3.1 采用碳酸钠和双氧水联合对啤酒糟进行预处理，再采用生物酶解技术将啤酒糟中的半纤维素转化成低聚木糖，提高了啤酒糟的饲用价值和附加值。

3.2 通过单因素试验和正交试验可以得出，利用啤酒糟生产富含低聚木糖饲料添加剂预处理适宜条件为碳酸钠添加量0.7%，双氧水添加量0.1%，固液比1∶5，预处理温度115℃，预处理时间30 min。在此条件下，低聚木糖产量为19.4693 mg/g。

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