RP-HPLC法同时测定藏药十三味青兰散中3种有效成分的含量

闫晓娟，翟华强，鲁晓光

(1.廊坊市广阳区妇幼保健院，廊坊 065000； 2.北京中医药大学，北京 102488；3.南阳市食品药品检验所，南阳 473061)

十三味青兰散系藏药常用方剂，主要由甘青青兰、木香、余甘子、石榴子、巴夏嘎、矮紫堇、酸藤果、豆蔻、荜茇、干姜和芫荽果等13味药组成，理气健胃，消炎止痛，用于治疗“培根木布”病引起的急慢性胃炎、溃疡性胃炎、萎缩性胃炎、十二指肠溃疡、胆汁反流性胃炎、胃绞痛、腹胀、胃痛、腹痛、胃酸、呕吐和食积不化等症，其生理功能为运化食物、调节水液等。关于十三味青兰散的质量标准主要为《卫生部颁藏药标准》(第一册)[1]，其标准只有性状、项目检查，且无关于十三味青兰散的文献报道，为了更好的对藏药十三味青兰散进行质量监控[2]，本文选择其处方中用量最多的木香和具有温中散寒、下气止痛功效的荜茇进行质量控制，建立了能同时测定十三味青兰散中木香、荜茇的活性成分木香烃内酯、去氢木香内酯[3-15]和胡椒碱[16-18]含量的方法，结果表明，本方法操作简便、重复性好，可有效控制藏药十三味青兰散的质量。

1 仪器与试药

1.1仪器 Waters 2695高效色谱系统-2996 PDA检测器(沃特世科技公司)；KQ2200E超声波清洗器(昆山市超声仪器有限公司)；西特电子天平BL-310A(美国Setra公司)。

1.2试药 胡椒碱(批号110775-21104)、木香烃内酯(批号111524-201509)、去氢木香内酯(批号111525-201510)，均购自中国食品药品检定研究院；十三味青兰散(批号：160901，160902，160903)，北京中医药大学自制；甲醇为色谱纯(美国天地有限公司)；水为超纯水。

2 方法与结果

2.1色谱条件及系统适用性 Welchrom Materials C18色谱柱(250 mm×4.6 mm，5 μm)；以甲醇-水(65∶35)为流动相；流速：1.0 mL·min-1；柱温：35 ℃；紫外检测波长：205 nm，运行时间为30 min，进样量为10 μL。理论塔板数按照木香烃内酯计算应不低于5 000。在上述条件下，胡椒碱、木香烃内酯和去氢木香内酯的色谱峰，峰形基本对称，各色谱峰左右无干扰，阴性样品溶液对测定无干扰。见图1。

2.2混合对照品溶液的制备 分别精密称取胡椒碱、木香烃内酯和去氢木香内酯对照品各10.43，16.21和24.67 mg，分别置于10 mL量瓶中，加甲醇溶解并稀释至刻度，摇匀，即得质量浓度分别为1.031 7，1.604 8和2.459 6 mg·mL-1的系列对照品储备液，再精密吸取各储备液2 mL，置于同一20 mL量瓶中，加甲醇溶解并稀释至刻度，摇匀，即得质量浓度分别为0.103 5，0.160 5和0.246 mg·mL-1混合对照品溶液。

2.3供试品溶液的制备 精密称取供试品粉末1 g，精密加入甲醇25 mL，密塞，称定质量，超声处理(功率250 W，频率40 kHz)30 min，放冷，再称定质量，用甲醇补足减失的质量，摇匀，滤过，取续滤液作为供试品溶液。

2.4阴性样品溶液的制备 按照十三味青兰散处方制得不含荜茇和木香的样品，按照2.3项下供试品溶液制备方法制备阴性样品溶液。

图1HPLC图

A.混合对照品；B.样品；C.阴性样品；1.胡椒碱； 2.木香烃内酯； 3.去氢木香内酯。

Fig.1 HPLC chromatograms

A.reference substance；B.sample；C.negative sample；1.piperine；2.costunolide；3.dehydrocostus lactone.

2.5线性关系考察 精密吸取2.2项下制备的混合对照品溶液1.0，5.0，10.0，15.0和20.0 μL，按照2.1项下色谱条件进样分析。以组分质量为横坐标(x)、峰面积为纵坐标(y)，进行线性回归。结果胡椒碱、木香烃内酯和去氢木香内酯回归方程分别为：y=27 625 931x-113 769 (r=0.999 3)，y=22 474 980x-156 285(r=0.999 9)，y=29 420 624x-383 634(r=0.999 6)；其进样质量分别在0.010 4～0.206 9，0.016～0.321和0.024 6～0.491 9 μg范围内线性关系良好。

2.6精密度实验 精密吸取2.2项下制备的混合对照品溶液，按照2.1项下色谱条件重复进样6次，记录峰面积及保留时间，计算胡椒碱、木香烃内酯和去氢木香内酯的峰面积RSD值，其保留时间RSD值分别为0.07%，0.18%和0.08%，其峰面积RSD值分别为1.27%，0.70%和1.40%，结果表明，保留时间及峰面积精密度良好。

2.7稳定性实验 精密吸取同一份供试品溶液，分别按照2.1项下色谱条件，在0，2，4，6，8，12和24 h重复进样，记录胡椒碱、木香烃内酯和去氢木香内酯的峰面积，计算RSD值分别为0.71%，1.08%和0.85%，结果表明，供试品溶液在24 h内稳定。

2.8重复性实验 取同一批号样品，按照2.3项下方法平行制备6份供试品溶液，按照2.1项下色谱条件进样，测得胡椒碱、木香烃内酯和去氢木香内酯的峰面积，计算RSD值分别为1.29%，1.55%和1.02%，结果表明，该方法重复性良好。

2.9加样回收率实验 精密称取已知样品(批号160901)6份，每份0.5 g。置于具塞锥形瓶中，每2份样品中分别精密加入混有一定量的混合对照品溶液(精密量取2.2项下制备的混合对照品溶液1，2和3 mL，分别置于50 mL量瓶中，加入甲醇稀释至刻度，摇匀)25 mL，按照2.3项下方法制备供试品溶液，再按照2.1项下色谱条件分别测定。计算平均回收率，结果见表1。

2.10样品含量测定 精密称取3批样品(批号：160901，160902，160903)，按照2.3项下制备供试品溶液，再按照2.1项下色谱条件进样。以外标法(峰面积)进行计算，结果表明，3批藏药十三味青兰散含胡椒碱、木香烃内酯和去氢木香内酯分别为2.12，3.50和5.47 mg·g-1；1.78，3.18和5.05 mg·g-1；1.87，3.21和5.08 mg·g-1。

3 讨论

3.1检测波长的选择 通过PAD检测器在紫外光波范围扫描得知，木香烃内酯和去氢木香内酯的最大吸收峰波长为203 nm，胡椒碱的最大吸收波长在345 nm，但其次高峰在202 nm处，综合考虑，选择波长203 nm作为检测波长。

3.2流动相的选择 通过比较乙腈-1 mL·L-1磷酸溶液系统、乙腈-水系统和甲醇-水系统，比较各系统不同比例发现：甲醇-水(65∶35)对各组分可以达到很好的分离效果，且操作简单，因此选择其作为该实验流动相系统。

3.3供试品溶液的制备方法 本实验经查询相关资料，选定甲醇、乙酸乙酯和三氯甲烷3种溶液，超声和回流2种方式，10，20，30，40，50和60 min 6个时间段，通过实验比较：采用甲醇溶液提取含量最高，超声比回流提取含量要高，而提取时间在40 min后含量提高不是太明显，综上考虑，选择最简单的甲醇溶液超声40 min作为供试品溶液的制备方法。

3.4小结 藏药十三味青兰散作为用于治疗 “培根木布”病引起的胃肠溃疡绞痛、脘腹胀痛和急慢性胃炎的常用药物，长期以来其简单的质量标准，不利于民族药的发展，为了促进藏药的发展，本文特针对处方中用量最多的木香和具有温中散寒、下气止痛功效的荜茇进行质量控制，建立了同时测定十三味青兰散中的木香、荜茇活性成分胡椒碱、木香烃内酯和去氢木香内酯含量的方法，该方法操作简单、方便，可为今后藏药十三味青兰散质量标准[19-20]的提高提供参考。

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