提高咽炎颗粒的质量标准研究

王 锦，马善波，李 龙，唐俊峰，杨志福，石小鹏，文爱东，曹金一*

(1.陕西中医药大学，咸阳 712046；2.空军军医大学西京医院药剂科，西安 710032)

咽炎颗粒[兰制字(2011)F68094]处方由菊花、金银花和甘草等8味药组成，具有清热解毒、滋阴降火和润燥利咽的功效。用于急、慢性咽炎[1]。原质量标准中主要检测项目仅有绿原酸和甘草的TLC鉴别[2-4]，不能很好地对该中成药进行质量控制。为了进一步满足质量控制[5-7]的要求，在本次质量标准提高的工作中，我们对原标准进行了完善和提高，在原有基础上，增加了处方中的菊花的TLC鉴别，同时还增加了菊花和金银花中总的绿原酸的含量测定TLC，从而可更好地控制其质量。现行质量标准的提高在很大程度上增加了对产品质量的可控性[8-10]。

1 仪器与试药

1.1仪器 LC-2010AHT高效液相色谱仪(日本岛津公司)；KQ-250DE型数控超声波清洗器(上海精密仪器仪表有限公司)；Sartorius CPA225D电子天平(德国赛多利斯集团)；UV-2600 紫外-可见分光光度计(尤尼柯上海仪器有限公司)；ZF-2型紫外光灯分析仪(上海安亭电子仪器厂)；UPDR-11-20L超纯水机(西安优普仪器设备有限公司)。

1.2试药 咽炎颗粒：西京医院药剂科(批号:150205，150104，150206)。阴性对照：缺菊花、金银花阴性样品，缺菊花阴性样品(西京医院药剂科提供，均按照咽炎颗粒工艺制成)；绿原酸对照品(批号110753-201415，供含量测定用，质量分数99%)，菊花对照药材(批号121384-201103)，均由中国食品药品检定研究所提供；乙腈(色谱纯，默克化工上海技术公司)；超纯水；硅胶G(青岛海洋化工厂分厂生产，TLC色谱用)；聚酰胺薄膜(浙江台州市路桥四甲生化塑料硬厂)；正己烷、乙酸乙酯、丁酮、甲酸、石油醚(60～90 ℃)、乙酸、石油醚(30～60 ℃)、甲苯、苯、三氯甲烷、盐酸、甲醇、乙醇、三氯化铝和三氯化铁，均为分析纯(天津市富宇精细化工有限公司)；自制纯化水。

2 方法与结果

2.1菊花的TLC鉴别 取咽炎颗粒30 g，研细，置于100 mL锥形瓶中，加甲醇30 mL，超声处理20 min，滤过，蒸干，残渣加水20 mL使其溶解，加稀盐酸调节pH值至2，用乙酸乙酯提取3次，每次20 mL，合并提取液，蒸干，残渣加甲醇1 mL使溶解，作为供试品溶液。精密称取菊花[11-13]对照药材1 g，加稀盐酸1 mL和乙酸乙酯20 mL，超声处理30 min，滤过，蒸干滤液，残渣加甲醇1 mL使溶解，作为对照药材溶液。取阴性对照样品30 g，按照上述供试品溶液制备方法制成阴性对照溶液。

参照TLC法，(《中国药典》2015年版一部附录ⅥB)实验，分别吸取上述阴性对照溶液、3批咽炎颗粒供试品溶液和对照药材溶液5，5和2 μL，依次点于同一硅胶G板上，以7∶4∶0.5比例的甲苯-乙酸乙酯-甲酸为展开剂，展开，取出，晾干，置于紫外光灯365 nm下检视。菊花对照药材与阴性对照相应的位置无相同斑点，表示无干扰;在供试品溶液色谱中，与菊花对照药材色谱相应的位置上，显相同颜色大小的荧光斑点。故将此法列入新提升质量标准中，见图1。

图1TLC图

1.阴性对照溶液；2～4.咽炎颗粒供试品；5.菊花对照药材。

Fig.1 TLC chromatograms

1.negative control sample；2-4.sample of Pharyngitis Granules；5.Chrysanthemumcontrol.

2.2菊花和金银花中绿原酸的含量测定

2.2.1色谱条件与系统适用性 色谱条件ECOSIL C18色谱柱(250 mm×4.6 mm，5 μm)；流动相：乙腈-4 mL·L-1磷酸溶液=13∶87；流速：1.0 mL·min-1；检测波长：328 nm；柱温：30 ℃；进样量：10 μL。理论塔板数按照绿原酸峰计算应不低于2 000。

2.2.2溶液的制备 对照品溶液:取绿原酸对照品适量，精密称定，置于棕色量瓶中，加甲醇制成质量浓度为50 μg·mL-1的溶液，即得。

供试品溶液：取咽炎颗粒2 g，研细，置于50 mL锥形瓶中，加入体积分数为50%的甲醇35 mL，超声处理40 min，放冷，摇匀，滤过，移至50 mL量瓶中，用体积分数为50%的甲醇定容至刻度，即得。

阴性样品溶液:取缺菊花[14-15]和金银花[16-17]的阴性对照样品2 g，按照上述供试品溶液制备方法，制成阴性对照溶液。

2.2.3专属性实验 取绿原酸[18-20]对照品溶液，以甲醇为空白对照，在280～350 nm范围扫描，绿原酸的最大吸收波长为328 nm。

按照2.2.1项下色谱条件，将上述制备好的对照品溶液、供试品溶液和阴性对照溶液，分别注入高效液相色谱仪测定，结果显示，供试品溶液在与对照品溶液相同保留时间处有一致的色谱峰，阴性对照溶液在与对照品溶液相同保留时间处无吸收峰。见图2。

图2HPLC图

A.绿原酸对照品；B.供试品；C.阴性样品；1.绿原酸。

Fig.2 HPLC chromatograms

A.chlorogenic acid control sample；B.sample;C.negative sample；1.chlorogenic acid.

2.2.4线性关系考察 精密称取绿原酸对照品11.15 mg，置于100 mL棕色量瓶中，加甲醇使溶解制成质量浓度为111.5 μg·mL-1的对照品溶液。精密吸取此对照品溶液各2，4，6，8和10 μL，按照2.2.1项下色谱条件测定，记录峰面积，计算并绘制标准曲线，以对照品溶液进样量为横坐标(x)、峰面积为纵坐标(y)，得回归方程(含量测定)y=3 051.035 8x+17 842.50；r=0.999 8。结果表明，绿原酸进样量在214.526～1 072.63 ng之间线性关系良好。

2.2.5精密度实验 取质量浓度为111.5 μg·mL-1的绿原酸对照品溶液，精密吸取10 μL，连续进样5次，记录绿原酸的峰面积，结果RSD值为0.42%(n=5)，结果表明，色谱仪精密度良好。

2.2.6稳定性实验 精密吸取2.2.2项下咽炎颗粒供试品溶液(批号150205)，分别于0，3，6，9和12 h进样，记录峰面积，计算得RSD值为0.95%(n=5)，结果表明，供试品溶液在12 h内基本稳定。

2.2.7重复性实验 取同一批次咽炎颗粒样品(批号150205)，按照2.2.2项下方法制备6份平行供试品溶液，按照拟定的含量测定方法，对绿原酸进行含量测定，计算结果显示，绿原酸的平均含量为1 367.28 μg·g-1，RSD值为1.8%(n=5)，结果表明，该方法重复性好。

2.2.8加样回收率实验 取已知含量的咽炎颗粒样品(批号150205，绿原酸含量1 367.28 μg·g-1)6份，进行加样回收实验。取咽炎颗粒1 g，研细，精密称定，加入绿原酸对照品溶液15 mL (质量浓度为111.5 μg·mL-1)，按照2.2.2项下供试品溶液制备方法进行制备。各精密吸取10 μL，进行含量测定，计算回收率。结果回收率为98.1%，RSD值为1.9%(n=5)。结果表明，本含量测定方法准确度良好，结果见表1。

表1绿原酸加样回收率测定结果

Tab1.Results of the recovery rate of chlorogenic acid

序号取样量/g原有绿原酸量/μg加入绿原酸量/μg测得绿原酸总量/μg回收率/%平均回收率/%RSD/%11．01371386．0121608．9452952．56597．3798．11．921．02021394．8991608．9452961．71097．3831．01491387．6521608．9452947．05596．9241．01871392．8481608．9452943．54596．3851．02441400．6421608．9453032．270101．4161．02091395．8561608．9452996．49599．48

2.2.9样品含量测定 取咽炎颗粒样品3批(批号：150205，150104，150206)，按照2.2.2项下方法制备供试品溶液，每批平行取样2份，按照2.2.1项下色谱条件测定，每份测定2次，计算绿原酸含量分别为21.8，21.7和21.5 mg·袋-1。

3 讨论

在TLC实验中，菊花的鉴别为新增项目，根据咽炎颗粒标准提高技术要求，对咽炎颗粒中的菊花进行了TLC方法研究。用石油醚提取后，分别比较了用甲苯-乙酸乙酯-甲酸-冰乙酸-水(2∶30∶2∶2∶4)上层液；苯-乙酸乙酯-甲酸(8∶2∶0.5)；甲苯-乙酸乙酯-甲酸(7∶3∶0.5)，预饱和10 min；甲苯-乙酸乙酯-甲酸(7∶4∶0.5)为展开剂，均发现分离效果不理想或显色斑点不清晰；又用甲醇和乙酸乙酯提取后，用以上展开剂分别实验，经过多次实验，最终确定了以甲醇和乙酸乙酯提取，甲苯-乙酸乙酯-甲酸(7∶4∶0.5)为展开剂，分离度好，斑点显色清晰，阴性对照无干扰。

HPLC法测定金银花与菊花中绿原酸总含量在本实验中为新增项目。用HPLC法测定金银花与菊花中绿原酸总含量来进行质量控制，可以更全面地反映咽炎颗粒的质量，从而更好地对其质量进行控制。

本实验所建立的方法，可作为咽炎颗粒的检测方法纳入新提升的质量标准中，符合《军队医疗机构制剂质量标准提高技术要求》。

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