超高效液相色谱串联质谱法测定人血浆中苯溴马隆的质量浓度

洪 慧，梁文忠

(1.上海交通大学生命科学技术学院，上海 200240；2.上海药明康德新药开发有限公司生物分析服务部，上海 200131)

近年来伴随高脂血症、肥胖症、糖尿病和高血压等疾病的高发，导致高尿酸血症及痛风的发病率在全球范围内呈逐年上升的趋势[1-10]。目前，我国临床主要采用苯溴马隆等西药治疗原发性和继发性高尿酸血症，以及各种原因引起的痛风。苯溴马隆为苯并呋喃衍生物，属于β受体阻滞剂，能抑制肾小管对尿酸的重吸收，促进尿酸排泄，是良好的嘌呤氧化酶抑制剂，具有抑制尿酸生成的作用，对降低血中尿酸质量浓度达到双重效果[11-16]。

根据目前发表的国内外文献报道，现有的定量测定血浆中苯溴马隆的方法有HPLC法[17-20]和GC-MS法[21]，采用LC-MS法[22]只是定性分析其代谢产物，尚未见文献中报道采用液质联用方法来定量分析血浆中苯溴马隆的质量浓度。本文首次建立用LC-MS/MS法测定人血浆中苯溴马隆的质量浓度，具有简单稳定、快速、特异性高等特点，可同时满足临床药代动力学研究及生物等效性研究中大批量样品快速分析的要求。

1 仪器与试药

1.1仪器 API6500型三重四极杆质谱仪(美国Sciex公司)，配有大气压化学电离源(APCI)及Analyst 1.6.3分析软件；Nexera UHPLC超高效液相色谱仪(日本岛津公司)，配有自动进样器及柱温箱等。

1.2试药 苯溴马隆标准对照品(加拿大TRC公司，批号2-BLH-83-1，质量分数98.0%)；苯溴马隆EP Impurity B对照品(加拿大TLC公司，批号2441-002A3，质量分数99.5%)；色谱纯级甲醇、乙腈(美国Merck公司)；醋酸铵(加拿大Fluka公司)；甲酸(美国Sigma-Aldrich公司)；去离子纯水由实验室ELGA纯净水发生器制备。

2 方法

2.1液相色谱-质谱条件

2.1.1色谱条件 色谱柱为Waters Acquity UPLC®BEH C18色谱柱(50 mm×2.1 mm，1.7 μm)；流动相为分别含1 mL·L-1甲酸的2 mmol·L-1醋酸铵的水溶液(A)和乙腈(B)；梯度洗脱程序为[0 min，A∶B(45∶55)→1.6 min，A∶B(5∶95)→2.0 min，A∶B(5∶95)→2.01 min，A∶B(45∶55)→2.5 min，A∶B(45∶55)]；流速：0.6 mL·min-1；柱温：60 ℃；进样量为3 μL。

2.1.2质谱条件 离子源为大气压化学电离源(APCI)，负离子模式检测；扫描方法为多反应监测(MRM)；苯溴马隆和苯溴马隆EP Impurity B的检测离子对分别是m/z422.7→250.8和m/z502.6→250.9，去簇电压(DP)分别为-45 V和-80 V，碰撞能(CE)分别为-42 V和-50 V，雾化电流为-3 mA；离子源温度为450 ℃；气帘气流速为40 psi，喷雾气流速为50 psi，各离子通道扫描时间为100 ms，相应的二级质谱图见图1。

图1二级质谱扫描图

A.苯溴马隆；B.苯溴马隆EP Impurity B。

Fig.1 Product Ion spectra

A.benzbromarone；B.benzbromarone EP Impurity B.

2.2溶液的制备

2.2.1对照品溶液 精密称取苯溴马隆标准对照品适量，置于4 mL棕色玻璃瓶中，加入二甲亚砜(DMSO)溶解至质量浓度为1 mg·mL-1的对照品储备液。将上述储备液用乙腈-水(7∶3)溶液按照梯度稀释成质量浓度为1 000，2 000，5 000，10 000，20 000，100 000，180 000和200 000 ng·mL-1的系列对照品溶液，置于-20 ℃冰箱中保存，备用。

2.2.2内标溶液 精密称取苯溴马隆 EP Impurity B对照品适量，置于4 mL棕色玻璃瓶中，加DMSO溶解至质量浓度为1 mg·mL-1的内标储备液。将上述内标储备液用乙腈-水(7∶3)溶液稀释至质量浓度为8 000 ng·mL-1，即得，置于-20 ℃冰箱中保存，备用。

2.2.3样品前处理 精密移取血浆50 μL，置于96孔板中，加入20 μL内标溶液，置于摇板机中混匀2 min，加入330 μL乙腈沉淀，摇匀10 min，于4 ℃条件下，以4 000 r·min-1离心15 min。取上清液100 μL，移至另一块96孔板中，加入200 μL乙腈-水溶液(1∶1)稀释，摇匀。取3 μL进样检测。

2.3专属性考察及干扰考察 本实验采用的质谱和色谱条件下，人空白血浆，空白血浆+苯溴马隆以及空白血浆+苯溴马隆+苯溴马隆EP Impurity B的色谱图见图2。由图2可知，空白基质中的内源性物质对待测物无干扰；内标对待测物不存在干扰，只存在串扰(crosstalk)现象，在色谱上两者有明显的分离，不影响待测物分析；作为内标的化合物是待测药物工艺合成过程中产生的杂质，因此待测物最高定量上限(ULOQ)对内标通道信号有一定贡献，通过适当调整加入的内标质量浓度，使其干扰峰面积远小于5%的内标峰面积平均值，可满足生物样品分析方法指导原则的要求。

2.4标准曲线与线性范围 分别精密吸取系列对照品溶液20 μL，加入380 μL的空白血浆中，涡旋混匀，配制得到质量浓度为50，100，250，500，1 000，5 000，9 000和10 000 ng·mL-1的血浆样品，按照血浆样品预处理方法进行操作，以不同质量浓度对照品样品测得的苯溴马隆与内标峰面积比值为纵坐标(y)、苯溴马隆质量浓度为横坐标(x)，用加权最小二乘法进行线性回归，方程为y=0.000 35x+0.000 63(r=0.999)。苯溴马隆线性范围：50～10 000 ng·mL-1，方法定量下限为50 ng·mL-1。

图2HPLC图

A.空白血浆；B.空白血浆+苯溴马隆(10 000 ng·mL-1)；C.空白血浆+苯溴马隆(50 ng·mL-1)+苯溴马隆EP Impurity B；(左：苯溴马隆；右：苯溴马隆EP Impurity B)。

Fig.2 HPLC chromatograms

A.blank plasma；B.blank plasma+benzbromarone(10 000 ng·mL-1)；C.blank plasma + benzbromarone (50 ng·mL-1)+ benzbromarone EP Impurity B；(Left：benzbromarone；Right:benzbromarone EP Impurity B).

2.5方法精密度和准确度 按照苯溴马隆标准曲线制备方法制备质控样品，对定量下限(LLOQ)和低、中和高4个质量浓度(分别为50，150，4 000和8 000 ng·mL-1)样品进行了连续3 d的6份样品分析。以同一批次的2条随行标准曲线计算实测质控样品的质量浓度，评价方法的批内、批间精密度，其RSD值均小于5%,结果表明，精密度和准确度良好，符合接受标准。

2.6绝对回收率和基质效应 按照苯溴马隆标准曲线制备方法制备低、中和高3个质量浓度的质控样品，按照血样预处理后进样分析，记录药物峰面积。与相同质量浓度的空白基质提取后添加待测物的样品进样得到的峰面积进行比较，计算苯溴马隆提取回收率(n=6)，3个质量浓度的质控样品回收率分别是102%±5.08%，103%±3.09%和100%±3.96%，其RSD值均小于4%。

提取6个不同批次的单人空白血浆即得空白基质样品。向空白基质样品中添加待测物和内标溶液，使其最终质量浓度与进样时的低、中和高3种质量浓度一致，各质量浓度平行3份。同时配制含有待测物和内标溶液的参比溶液，同样配制低、中和高3种质量浓度。比较空白基质样品和参比溶液中待测物和内标的峰面积，计算得到苯溴马隆的3种质量浓度基质效应因子分别是97.8%±3.49%，98.6%±1.43%和100%±1.93%，其RSD值均小于4%。

结果表明，内标的提取回收率在3种质量浓度的质控样品中保持一致，且无基质效应。同时考察溶血和含高脂血的血浆样品的基质效应，均符合分析接受标准。

2.7稳定性考察 考察标准血浆样品在各条件下的稳定性，按照2.2.3项下方法对血浆进行前处理后，测定其主峰与内标峰面积的比值，根据RSD值及准确度进行判断。不同条件下各质量浓度平行取3份，分别于室温放置4和24 h以及4 ℃冰箱中放置24 h，结果表明，苯溴马隆的质量浓度无改变，常规稳定性良好；分别置于-20与-80 ℃冰箱中，反复融冻3次，结果表明，苯溴马隆的质量浓度保持稳定，冻融稳定性良好；分别置于-20与-80 ℃冰箱保存55 d，结果表明，苯溴马隆各质量浓度均未发生改变，长期稳定性良好。另外，还考察了对照品溶液的室温稳定性，结果表明，室温条件下放置54 h稳定。

2.8生物等效性研究中的应用 出于与客户间保密协议的考虑，不便公开发表药代动力学参数相关数据。这里仅展示实际样品分析阶段中某健康受试者口服苯溴马隆片后1 h的色谱分析图，见图3。

图3实际样品HPLC图

A.苯溴马隆；B.苯溴马隆EP Impurity B。

Fig.3 HPLC chromatograms of incurred sample

A.benzbromarone；B.benzbromarone EP Impurity B.

3 讨论

苯溴马隆EP Impurity B与苯溴马隆结构极其类似，只相差1个-Br基团，二者在质谱内裂解位点相同，具有部分相同的碎片离子峰。笔者选择了质谱响应最强的250.8作为子离子监测。苯溴马隆极性较小，易溶于有机试剂，因此文献中的前处理大多采用有机溶剂提取法[21]，但前处理所需时间较长且操作繁琐。本实验采用简单的蛋白沉淀法，用乙腈对血浆样品进行蛋白沉淀，方法简便、经济、回收率高。质谱采用APCI离子源[23]，有效地消除了待测物的基质效应。同时采用了亚2微米色谱柱，提高柱温至60 ℃，极大地提高了色谱分离度，缩短了分析时间[24]。

在没有商业化的同位素标记内标出售的前提下，经过评估，最终选择了与苯溴马隆结构相似的苯溴马隆EP Impurity B作为内标化合物。虽然它属于待测物对照品中的1种杂质，但由于其含量极低，对待测药物的分析无干扰，且具有与待测药物较接近的保留时间，相近的提取回收率(大于93%)和基质效应(98.5%～100.6%)，是一个适合的内标。购买商品化对照品经济便宜，无需花费时间和更高成本去合成同位素内标。

本研究首次建立一种高效的LC-MS/MS法测定人血浆中苯溴马隆的质量浓度，并成功应用于生物等效性样品分析。此方法简单稳定，分析速度快，分析效率明显优于目前已有的文献报道[17-21]，可满足临床药代动力学研究及生物等效性研究中大批量样品快速分析的要求。

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