利用基因芯片筛选与银屑病发病相关的GPCR家族基因

支媛婷 ，许鹏 ，党永岩 ，叶希韵 ，顾军

（1.上海长海医院，上海 200433；2.华东师范大学生命科学院，上海 200241）

银屑病是一种常见的慢性炎症性皮肤疾病。G蛋白耦联受体（G-protein coupled receptors，GPCRs）超家族是目前最大的与信号转导相关的细胞表面分子家族[1]。已有研究发现大量的趋化因子和趋化因子受体在银屑病皮损区的表达较无皮损区皮肤明显增多，但是GPCRs是否在银屑病发病过程中发挥重要作用还不清楚[2]。银屑病是由T细胞介导的一种自身免疫性疾病，可以导致角质形成细胞的过度增殖[3]。起初银屑病被认为是Th1细胞介导的免疫性疾病。后来，人们发现Th17细胞及其下游因子也对银屑病的发生和发展产生影响[4-5]。其可以产生肿瘤坏死因子（TNF）、白细胞介素（IL）-17、IL-12、IL-22和IL-23等细胞因子从而激活角质形成细胞，导致角质形成细胞的过度增殖[6]。虽然已有大量针对银屑病的发病机制的研究，但银屑病的具体病因目前尚不明确。

GPCRs超家族内包含了超过了人类基因组1%的基因[1]。GPCRs在炎症反应中起到十分重要的作用，炎症性细胞通过表达并激活大量GPCRs（如化学诱导剂、趋化因子、转录因子），促使炎症因子的合成和分泌[1]。例如，GPCRs激活可以激活NF-κB，从而促进炎症因子的表达[7]。鉴于银屑病是一种常见的皮肤慢性炎症性疾病，而GPCRs在调控炎症中起到一定的作用，推断GPCRs在银屑病的发病机制可能具有一定的作用。有研究发现GPCRs家族中的CCR6，在IL-23诱导的小鼠银屑病模型的皮损中的表达量明显增加[8]。然而，GPCRs在银屑病中的具体能够还不明确。

人们最早是通过抑制表皮角质形成细胞的增生治疗银屑病[9]。近来有研究发现减少T细胞的增殖和扩散也能控制银屑病的发生和发展[10]。目前临床上有很多用于治疗银屑病的药物和方法，但是没有一种方案可以根治银屑病。近年来，随着人们对GPCRs的深入研究，发现包括多种趋化因子在内的GPCRs是一种良好的潜在药物靶点[11-12]。因此，本研究希望通过研究GPCRs在银屑病发病机制中的作用，探讨运用抑制G蛋白耦联受体的方法治疗银屑病的可能性，为后期寻找银屑病的新的治疗靶点提供依据。

本研究利用基因芯片检测技术和实时定量PCR的方法检测了银屑病患者受累皮肤组织与未受累皮肤组织中，具有差异性表达的GPCRs（变化倍数>2倍，P<0.05）。利用实时荧光定量PCR（RTPCR）用于验证基因芯片的检测结果。笔者的实验结果挑选出了可能与银屑病发病相关的GPCRs，为银屑病的研究提供一定的帮助。

1 材料与方法

1.1 实验材料 本实验选取上海长海医院皮肤科3例寻常型银屑病（斑块型银屑病）患者，要求2年内无特殊治疗史，记录患者年龄、性别、病史，签署局麻下皮肤活检术知情同意书及有创操作知情同意书。选取双下肢同个部位（双下肢远端屈侧）对称分布的银屑病皮损和未受累皮肤，分别行局麻下皮肤活组织检查术。将切取的皮肤组织分别放入6个冷冻保存管，实验组（即皮损组）标记为Ⅰa/Ⅱa/Ⅲa，对照组标记为Ⅰb/Ⅱb/Ⅲb，立即投入液氮冷冻，置于-80℃超低温冰箱保存。

1.2 HE染色 用4%多聚甲醛固定病人皮肤组织并将其包埋在石蜡中。组织切片呈约5 μm厚，置于载玻片上，进行苏木精-伊红染色。

1.3 RNA提取 从病人取下皮肤组织，迅速放入液氮中，使用TRIZOL试剂盒（Takara）分离RNA。分别使用QIAGEN RNeasy Mini Kit和RNA 6000 NanoLabChip Kit（Agilent Technologies，Waldbronn，Germany）测定RNA纯度和RNA完整性。质量检测：要求样品最小RIN≥7.0。

1.4 基因芯片杂交，洗涤和扫描 应用Agilent表达谱芯片（Agilent Sure Print G3 Human Gene Expression Microarray V3.0）进行基因芯片检测[13]。

1.5 差异基因的分析 应用GeneSpring GX软件版本12.0（Agilent Technologies）对基因表达进行标准化。GO和KEGG通路分析用于获得所有差异表达的基因。与参考RNA的表达水平相比，如果P<0.05，则确定基因差异表达，且变化倍数（FC）为>2或<1/2。

1.6 荧光实时定量PCR 总RNA体积为20 μL逆转录 2 μg，包括 5×RT SuperMix（Vazyme），无 RNA酶的ddH2O和模板RNA。将RT产物的等分试样用于定量RT-PCR分析。每个反应物由12.5 μL SYBR-绿（Takara），1 μL 100 nM 有义和反义引物，2μLcDNA和9.5μLH2O组成，总体积为25μL。PCR使用以下参数：95℃5 min，随后40个循环，95℃30 s，55℃30 s，72 ℃ 30 s。基因表达对GAPDH mRNA进行标准化。所用的引物序列见表1。

1.7 数据分析 数据以平均值±SD表示。t检验用于评估组之间的统计学差异；P<0.05表示差异有统计学意义。

2 结果

2.1 3例银屑病皮损的组织学表现 本实验选取的3例斑块型银屑病患者皮损的临床表现均较典型，可见双下肢大小不等的红色斑块，境界清晰，形状不规则，皮疹表面覆盖较厚白色鳞屑，见图1。HE染色结果显示表皮角化过度、角化不全，表皮颗粒层较正常组织减少，表皮大致呈杵状增生，真皮乳头上延，真皮乳头内可见毛细血管扩张充血，真皮乳头上方的表皮变薄，真皮浅层血管周围可见以淋巴细胞为主的炎细胞浸润，见图2。3例实验组皮损的病理表现符合斑块型银屑病的病理特点。

图1 3例银屑病患者皮损的临床照片

表1 Qpcr所需要的引物序列

图2 3例银屑病患者皮损的病理照片

2.2 GPCRs相关差异表达基因的筛选 图3是GPCRs家族基因芯片的热点图，利用基因芯片技术检测出GPCRs家族在银屑病皮损和未受累皮肤之间共有32个差异基因，其中有15个上调基因和17个下调基因。上调基因（差异倍数>2，P<0.05）包括CXCR6，GPR110，OXTR，GPR45，GPR171，CCR7，ACKR2，FZD5，CXCR4，CXCR2，PTARF，XCR1，LPHN2，GPR132，CCR5；下调基因（差异倍数<1/2，P＜0．05） 包括 BAI2，DRD4，ACKR1，F2R，ADRA2A，GPR146，CNR1，LGR6，GPRC5C，ADRA1B，CHRM3，OXGR1，NPY1R，GPR12，CHRM1，ADRB2，GPR182。

图3 GPCR家族在银屑病皮损和未受累皮肤之间的差异表达基因

图4 RT-PCR的结果与基因芯片的结果基本一致

2.3 GPCRs相关差异基因的验证 通过荧光定量PCRRT-PCR验证,得出的结论与基因芯片检测结果相似。实验组银屑病皮损中的CXCR6、GPR110、GPR171、CXCR2、PTAFR、LPHN2 这 6 个基因的表达要明显高于对照组正常皮肤。相反，GPR12、CHRM1、ADRB2、CHAM、NPY1R、ADRA1B、GPR182、ADAR2A、LGR6、GPRC5C、F2R 这 11 个基因相比于正常皮肤，在银屑病皮损中的表达呈下调趋势。因此，RT-PCR验证结果与基因芯片检测结果大致相同。

3 讨论

银屑病是一种慢性炎症的皮肤疾病，发病机制目前尚未十分明了。双生子研究、流行病学调查及HLA研究均表明银屑病的产生具有遗传倾向，对与银屑病发病相关基因表达的研究可为探索银屑病复杂病因奠定基础。

曾有研究报道CXCR6参与了银屑病的发病[8]。Claudia等[14]的研究表明CXCL16-CXCR6可介导CD8+T细胞进入皮肤组织，可引起银屑病的发生或加重。Kulke等[15]发现CXCR1和CXCR2诱导的中性粒细胞活化和CXCR2介导的角质形成细胞增生共同导致银屑病皮损的特征性变化。这些研究结果也证明了GPCRs在银屑病的发病过程中发挥作用。

本研究发现 6个 GPCR相关基因（CXCR6，GPR110，GPR171，CXCR2，PTAFR 和 LPHN2） 在银屑病皮损中明显上调，11个GPCR相关基因（GPR12，CHRM1，ADRB2，CHAM3，NPY1R，ADRA1B，GPR182，ADAR2A，LGR6，GPRC5C 和 F2R） 在银屑病皮损中有下调趋势。这项研究数据表明：这些差异性表达的基因可能在银屑病的发病过程中起到非常重要的作用，有可能是促进银屑病的发生，也有可能是保护的作用。这需要后续的一些机制实验去证明。

本实验发现并验证了人类银屑病皮损组织中较正常皮肤组织差异表达的基因。大约有32个GPCRs相关基因可能与银屑病发病相关。定量RTPCR进一步验证了这些基因中的17个基因在银屑病皮损和未受累皮肤组织之间的差异性表达。此结论将为深入研究GPCRs在人类银屑病发病过程中的作用提供有力帮助。

因此，GPCRs相关基因在银屑病皮损和未受累皮肤之间的差异表达可能将为揭示GPCRs在银屑病发病中的作用提供重要线索。

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