血清淀粉样蛋白A在寻常型银屑病皮损组织中的表达

于宁，李影，易雪梅，丁杨峰

（上海市皮肤病医院，上海 200050）

血清淀粉样蛋白A（Serum amyloid A,SAA）是一种组织淀粉样蛋白A的前体物质，属于急性期反应蛋白[1]。目前，在细菌、病毒感染、动脉粥样硬化、冠心病、急性移植排斥反应、肿瘤等疾病中均检测到血清SAA升高[2]。IL-23/Th17通路是银屑病发病的核心机制，近期研究发现，SAA在IL-23/Th17通路的活化过程中发挥一定作用[3-4]。本研究采用实时荧光定量PCR（Real-time PCR）和免疫组化法检测SAA在寻常型银屑病皮损表达分布差异的变化。

1 对象与方法

1.1 研究对象 2013年10月—2014年8月，在上海市皮肤病医院经临床及病理证实的寻常型银屑病患者11例，其中男6例，女5例。采用银屑病皮损面积和严重程度指数（PASI）评分，总评分PASI≥10及皮损面积>10%的中、重度寻常型银屑病患者。对照组织标本来自外科手术躯干或四肢部位的正常组织（8例）。将标本分2部分，各约50 mg组织，分别放入标记好的冻存管立即液氮速冻，-80℃冰箱保存，用于Real-time PCR检测；另一部分用4%甲醛固定，常规石蜡包埋，用于免疫组化。

1.2 主要试剂 SAA兔抗人多克隆抗体为英国Abcam公司产品；过氧化物酶标记羊抗兔抗体、二氨基联苯胺（DAB）酶底物显色试剂盒为武汉博士德生物技术有限公司产品。Real-time PCR试剂盒为宝生物工程（大连）有限公司产品。

1.3 方法

1.3.1 Real-time PCR法检测SAA的表达 冻存组织研磨后用应用相关试剂提取总RNA；紫外分光光度计测定RNA浓度和纯度。RNA经逆转录生成cDNA后，进行实时荧光定量PCR检测。引物设计合成SAA表达所需的引物序列上游为：5’-CGA AGC TTC TTT TCG TTC CTT-3’，下游为 5’-CAC CAT GGC CAA AGA ATC TC-3’；内参 GAPDH 上游5’-GGT CGG AGT CAA CGG ATT TG-3’;下游 5’-ATG AGC CCC AGC CTT CTC CAT-3’。选用两管反应体系对目的基因和内参照进行扩增，建立总体积为20 μL的逆转录反应体系。取2 μL cDNA进行PCR扩增，扩增条件：94℃预变性30 s，95℃变性5 s，58℃退火 34 s，60℃延伸 1 min，共进行 40个循环，循环结束后60℃延伸10 min，4℃保存。

1.3.2 免疫组化 石蜡标本切片脱蜡水化；0.01mol/L枸橼酸盐缓冲液高温高压修复2 min，室温自然冷却；3%H2O2室温避光孵育10 min；滴加SAA一抗，4℃湿盒孵育过夜；次日，再滴加二抗，室温孵育30 min后DAB显色，苏木素复染细胞核，梯度乙醇脱水，中性树胶封片。上述各步骤之间均以磷酸盐缓冲液（PBS）漂洗3次。每次实验均设立一个阴性对照，即PBS代替一抗，其余步骤相同，阴性对照DAB不能使其显色。所有组织染色条件相同。

1.3.3 免疫组化染色结果判定 光镜下观察，表现为棕黄色颗粒即SAA表达阳性，着色强度高于背景非特异性染色。由2位有经验的病理科医生采用双盲法观察每张切片，随机选取5个不重叠的高倍镜视野（×400），按染色强度和阳性细胞所占比例进行半定量测定。按染色强度评分：无着色计0分，淡黄色（弱）计1分，浅棕色（中）计2分，深棕色（强）计3分；按阳性细胞所占比例评分：<5%计0分，5%～25%计1分，26%～50%计2分，51%～75%计3分，>75%计4分，2种评分相加，≤3分判为阴性（-），>3分为阳性（+）。

1.4 统计学分析 采用SPSS 22.0软件进行统计学处理。对寻常型银屑病皮损、非皮损以及正常皮肤组织SAA与GAPDH比值进行单因素方差分析，实验结果以±s表示；采用卡方检验比较SAA蛋白表达阳性率。P<0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 SAA mRNA表达水平 Real-time PCR实验结果显示寻常型银屑病皮损组织mRNA表达强度明显高于正常组织（7.15±2.93 vs.2.36±1.49，P<0.05）；寻常型银屑病皮损组织表达高于皮损周围组织（7.15±2.93 vs.3.23±2.00，P<0.05）；而皮损周围组与正常对照组间差异无统计学意义（3.23±2.00 vs.2.36±1.49，P>0.05），见图 1。

图1 健康对照皮肤、寻常型银屑病皮损及周围正常皮肤组织中SAA mRNA表达情况比较。

2.2 免疫组化染色观察 正常皮肤中SAA染色主要位于表皮层的基底细胞层。在寻常型银屑病皮损中SAA染色阳性细胞弥漫分布于表皮层的棘细胞层，真皮乳头处单个核细胞也有表达。而SAA在病变周围组织亦表达于表皮层的基底细胞层，与正常对照组表达相近，见图2。

2.3 SAA蛋白表达情况 SAA在寻常型银屑病皮损组织中表达的阳性率为90.9%（10/11），高于皮损周围组（18.2%，2/11，χ2=11.73，P<0.01）和正常对照组（12.5%，1/8，χ2=11.68，P<0.01），而正常对照组与皮损周围组比较差异无统计学意义（χ2=0.11，P=0.73）。

3 讨论

急性期反应的重要特征是急性期蛋白的诱导表达且表达水平快速升高。常见的急性期蛋白包括SAA和C反应蛋白（C-reactive protein,CRP）[1]。在血管粥样硬化、类风湿性关节炎和炎症性肠病等许多炎症性疾病中，急性期蛋白已经成为一个重要的临床标记物。同时，急性期蛋白还参与调节天然免疫和适应性免疫反应。在小鼠哮喘模型中，SAA能够促进Th17细胞的分化维持[5]。在外周血单核细胞中，SAA还可诱导外周血单核细胞分泌IL-23[6]，而IL-23恰恰是Th17细胞分化和表型维持的关键细胞因子。此外，一项近期的研究显示：SAA可以通过Notch1信号通路，促进银屑病皮损部位真皮血管新生[7]。以上研究均提示，SAA可能在银屑病的发病过程中发挥一定作用。

图2 SAA在健康对照皮肤、寻常型银屑病皮损及周围正常皮肤的免疫组化染色（免疫组化染色×200）

IL-23/Th17轴失衡是银屑病发病机制中公认的经典理论。银屑病的IL-23/Th17轴从概念上可分为3个阶段：第一阶段真皮树突状细胞持续表达IL-23，维持Th17细胞持续活化并释放其特征性细胞因子IL-17和IL-22；第二阶段IL-17和IL-22作用于表皮角质形成细胞，诱导角质形成细胞过度增殖、活化；第三阶段活化的角质形成细胞分泌炎症细胞因子、趋化因子及抗菌肽，吸引并作用于真皮T淋巴细胞和树突状细胞等，正反馈放大炎症反应，触发并维持银屑病进程。

本研究通过Real-time PCR和免疫组化等方法表明，SAA在寻常型银屑病皮损中，尤其是表皮角质形成的细胞中过度表达，与正常对照组间差异有统计学意义，提示SAA可能不仅是一种存在于循环中的急性期蛋白，而且是一种重要的局部炎症介质。尽管以往的研究报道循环中的SAA主要来源于肝细胞，在多种组织器官中都可以检测出SAA的表达，包括动脉粥样硬化的斑块区、阿尔兹海默症患者脑组织以及类风湿性关节炎滑膜组织。笔者的观察扩展了以往的研究，证实银屑病患者皮损可能是另一种重要的SAA来源。银屑病表皮角质形成细胞产生的SAA可能通过旁分泌的形式作用于真皮内的免疫活性细胞以及血管内皮细胞，导致银屑病正反馈加重。

综上所述，SAA在寻常型银屑病皮损组织中表达明显增强，提示SAA在寻常型银屑病发生发展过程中可能发挥重要作用。但SAA对表皮角质形成细胞以及真皮免疫活性细胞的生物学效应，仍需深入研究。

参考文献：

[1] Ye RD,Sun L.Emerging functions of serum amyloid A in inflammation[J] .J Leukoc Biol,2015,98:923-929.

[2] Sodin-Semrl S,Zigon P,Cucnik S,et al.Serum amyloid A in autoimmune thrombosis[J] .Autoimmun Rev,2006,6:21-27.

[3] Mahil SK,Capon F,Barker JN.Update on psoriasis immunopathogenesis and targeted immunotherapy[J] .Semin Immunopathol,2016,38:11-27.

[4] Dogan S,Atakan N.Is serum amyloid A protein a better indicator of inflammation in severe psoriasis?[J] .Br J Dermatol,2010,163:895-896.

[5] Ather JL,Ckless K,Martin R,et al.Serum amyloid A activates the NLRP3 inflammasome and promotes Th17 allergic asthma in mice[J] .J Immunol,2011,187:64-73.

[6] He R,Shepard LW,Chen J,et al.Serum amyloid A is an endogenous ligand that differentially induces IL-12 and IL-23[J] .J Immunol,2006,177:4072-4079.

[7] Rooney P,Connolly M,Gao W,et al.Notch-1 mediates endothelial cell activation and invasion in psoriasis[J] .Exp Dermatol,2014,23:113-118.