养血祛风汤对特应性皮炎小鼠模型血清IgE、IL-4和IFN-γ的影响

汪洋，陈志伟，陈信春，朱文政，周翘楚，叶藤

（温州市中西医结合医院，浙江温州325000）

特应性皮炎（AD）是一种慢性、复发性、炎症性皮肤病，患者往往瘙痒剧烈，严重影响生活质量。本病的患病率呈上升趋势，2012我国年上海地区流行病学调查显示，3～6岁儿童患病率达8.3%（男8.5%，女 8.2%），城市显著高于农村（10.2%∶4.6%）[1]。我国传统医学在治疗本病上有着悠久的历史及理论经验，药物的安全性、有效性也得到了广大医患的认可。故笔者选用临床治疗AD疗效满意的经验方“养血祛风汤”进行实验研究。研究拟通过观察本方对AD动物模型皮损以及血清IgE、白细胞介素（IL）-4、干扰素（IFN）-γ水平的影响，探讨其在AD治疗中的作用及机制。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 实验动物 选取6周大清洁级BALB/c雄性小鼠30只，体质量（20±2）g，温州医科大学实验动物中心提供。先饲养1周，房间温度保持在（23±3）℃，湿度在50%左右，照明时间为8点～20点，自由取食。

1.1.2 药物与试剂 药物：养血祛风汤（茯苓、炒白术、白扁豆、薏苡仁、当归、黄芪、大血藤、荆芥、防风、僵蚕、白鲜皮、苍术、萆薢、黄芩、生甘草）浸泡30 min，煮沸后煎20 min，共煎2次，合并煎液、过滤、浓缩至1 g生药/mL（温州市中西医结合医院中药房提供）。试剂：生理盐水，2，4-二硝基氟苯（DNFB，石家庄鑫兆阳化工科技有限公司），丙酮，橄榄油，小鼠 IgE、IL-4、IFN-γ ELISA 试剂盒（Multi－Sciences公司生产）。

1.2 方法

1.2.1 动物造模 从30只小鼠中随机选取8只，进行正常饲养，余22只小鼠造模。参考文献[2] ，剃去背部毛发，面积约2.0 cm×3.0 cm。造模第1天采用 0.5%DNFB（丙酮∶橄榄油=4∶1）50 μL，使用毛刷均匀涂抹在小鼠背部剃毛区，连续2 d，第5天后改用 0.2%DNFB（丙酮∶橄榄油=4∶1）50 μL 涂于小鼠背部剃毛区，2次/周，连续4周。

1.2.2 皮损观察及组织病理 小鼠皮肤出现红斑、鳞屑、结痂、苔藓化等改变，同时随机选取2只模型小鼠，在皮损处进行组织病理检查，观察是否符合AD病理改变。小鼠取血后再次取对照组与实验组小鼠皮损处皮肤，观察病理改变。

1.2.3 分组及给药 造模成功后将剩余小鼠随机分成2组，对照组（生理盐水组）、实验组（养血祛风汤组）每组10只。各组灌饲相应药物，正常饲养的小鼠设为空白组，灌饲生理盐水，剂量约为临床成人用量的10倍，按25 mL/kg体质量计算，1次/d，连续15 d。

1.2.4 检测指标及方法 停药24 h后取材：摘除小鼠眼球，获得小鼠全血约0.5 mL，室温放置2 h后3 000转/min离心15 min，获取血清，于-20℃中保存，ELISA法检测血清中IgE、IL-4、IFN-γ水平。

1.3 统计学方法 运用SPSS 15.0统计软件进行分析处理，各组数据以（±s）表示，组间比较采用t检验。以P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 局部皮损表现 造模后小鼠背部皮肤可见红斑、干燥、脱屑、结痂等皮损改变，见图1。治疗15 d后实验组痂皮脱落，皮肤红斑及鳞屑基本消失，并出现黄色厚薄不一的痂皮，见图2。对照组小鼠痂皮部分脱落，仍有红斑、脱屑，苔藓化，见图3。

2.2 皮肤组织病理改变 造模后小鼠皮肤病理：可见角质层不规则角化过度及角化不全，局灶伴浆液性渗出；棘细胞层增厚，见海绵水肿及细胞内水肿；基底液化变性；真皮浅中层血管周见中等程度以淋巴细胞为主的炎细胞浸润，可见明显红细胞外溢，见图4。

图1 造模后皮损

图2 治疗后实验组皮损

图3 治疗后对照组皮损

图4 造模后小鼠皮肤病理（HE染色×200）

取血后小鼠皮肤病理：对照组：表皮可见棘细胞层增厚，轻度海绵水肿及细胞内水肿；基底局灶可见空泡变性或液化变性；真皮浅层血管周见轻度以淋巴细胞为主的炎细胞浸润及红细胞外溢，符合皮肤慢性炎症性改变，见图5；实验组：表皮可见棘细胞层稍增厚，轻度海绵水肿；真皮浅层见少量淋巴细胞浸润，无红细胞外溢，较对照组炎症改变减轻，见图6。

图5 取血后对照组小鼠皮肤病理（HE染色×200）

图6 取血后实验组小鼠皮肤病理

2.3 血清IgE、IL-4、IFN-γ水平 与空白组相比，对照组 IgE 水平显著升高（t=3.66，P＜0.01）；IL-4水平显著升高（t=3.36，P＜0.01）；IFN-γ 水平下降（t=2.87，P＜0.05）；与对照组相比，实验组 IgE 水平显著降低（t=2.52，P＜0.05）；IL-4水平显著降低（t=2.97，P＜0.01）；IFN-γ 水平升高（t=2.47，P＜0.05）。见表 1。

表1 3 组血清 IgE、IL-4、IFN-γ 水平 （±s）

表1 3 组血清 IgE、IL-4、IFN-γ 水平 （±s）

注：与空白组比较，*P<0.05；实验组与对照组比较，△P<0.05。

组别 n IgE（ng/mL） IL-4（pg/mL） IFN-γ（pg/mL）空白组 8 37.45±41.91* 1.28±0.80* 27.54±8.28*实验组 10 80.65±58.08△ 1.56±0.92△ 25.94±9.29△对照组 10 168.86±94.01*△ 3.07±1.32*△ 16.16±8.41*△

3 讨论

学者们在动物模型建立的反复实验中发现应用DNFB刺激BALB/c小鼠产生慢性炎症性皮肤改变，与人类AD的病理学及免疫性特征较为相似[3-4]，故本研究采用此方法建立AD动物模型，通过观察养血祛风汤对动物模型皮损变化、病理改变及血液中细胞因子的影响来探讨本方对AD作用。结果实验组小鼠皮损及病理的炎症性改变明显轻于对照组，表明本方有改善AD皮损的作用。

AD的发病机制尚不完全清楚，一般认为是在遗传因素基础上，由于变应原进入和微生物定植（如金黄色葡萄球菌和马拉色菌），形成皮肤免疫异常反应和炎症。而AD的异常免疫反应涉及多个环节，如朗格汉斯细胞和皮肤树突细胞对变应原的提呈、Th2为主的异常免疫反应、调节性T细胞功能障碍、IgE过度产生等[5]。许多研究表明AD患者中存在Th1/Th2失衡[6-7],在急性期以Th2细胞反应为主，活化的Th2细胞通过释放IL-4、IL-5、IL-13等细胞因子诱导B细胞产生IgE；在慢性期时，以Th1细胞因子为主，包括Th1细胞产生的IFN-γ、TNF-β、IL-2等细胞因子，参与细胞介导的免疫反应。本研究中对照组与空白组比较IgE、IL-4均显著增高，IFN-γ降低，实验组与对照组比较IgE、IL-4明显下降，IFN-γ升高。表明小鼠模型符合AD的免疫学改变，同时提示养血祛风汤有降低IgE、IL-4水平，升高IFN-γ水平，调节AD Th1/Th2因子失衡的作用，从动物实验中证实本方有治疗AD的作用。

AD属于中医“四弯风”范畴，因禀性不耐或脾虚湿盛所致，主要分为血虚风燥、风湿蕴肤两型[8]，血虚风燥表现为皮肤干燥肥厚，瘙痒抓痕血痂，以慢性表现为主，风湿蕴肤表现为皮肤潮红，瘙痒剧烈，抓之可糜烂渗出，以急性表现为主，而临床中AD又往往在两型之间反复，很难截然分开，方中炒白术、白扁豆、薏苡仁健脾以除湿，治脾虚之本，茯苓、萆薢、苍术、黄芩祛湿以健脾，治湿邪之标；当归、黄芪、大血藤，补气养血活血以治血虚生风之本，荆芥、防风、僵蚕、白鲜皮祛风以止痒，以治风邪瘙痒之标；生甘草补脾益气、调和诸药，本方诸药合用既可养血祛风，又可健脾除湿，标本兼治，攻补兼施。临床中可根据病症，调整药量以达到满意疗效。

参考文献：

[1] Xu F,Yan S,Li F,et al.Prevalence of childhood atopic dermatitis:an urban and rural community-based study in Shanghai,China[J/OL] .PLoS One,2012,7:e36174.

[2] Li YZ,Lu XY,Jiang W,et al.Anti-inflammatory effect of qingpeng ointment in atopic dermatitis-like murine model[J] .Evid Based Complement Alternat Med,2013,2013:907016.

[3] Inagaki N,Nagai H.Analysis of the mechanism for the development of allergic skin inflammation and the application for its treatment:mouse models for the development of remedies for human allergic dermatitis[J] .J Pharmacol Sci,2009,110:251-259.

[4] Samukawa K,Izumi Y,Shiota M,et al.Red ginseng inhibits scratching behavior associated with atopic dermatitis in experimental animal models[J] .J Pharmacol Sci,2012,118:391-400.

[5] 中华医学会皮肤性病学分会免疫学组、特应性皮炎协作研究中心.中国特应性皮炎诊疗指南（2014版）[J] .中华皮肤科杂志,2014,47（7）:511-514.

[6] Nograles KE,Zaba LC,Shemer A,et al.IL-22-producing“T22”T cells account for upregulated IL-22 in atopic dermatitis despite reduced IL-17-producing TH17 T cells[J] .J Allergy Clin Immunol,2009,123:1244-1252.

[7] Gittler JK,Shemer A,Suárez-Fariñas M,et al.Progressive activation of T（H）2/T（H）22 cytokines and selective epidermal proteins characterizes acute and chronic atopic dermatitis[J] .J Allergy Clin Immunol,2012,130:1344-1354.

[8] 国家中医药管理局.中华人民共和国中医药行业标准-中医病证诊断疗效标准[Z] .1994,06.