利用体外合成的mRNA 编辑间充质干细胞对神经胶质瘤DBTRG 细胞杀伤作用

付红霞 马志鹏 储承科 郭兴荣十堰市太和医院（湖北医药学院附属医院）检验科（湖北十堰 44000）；湖北医药学院附属太和医院胚胎干细胞研究湖北省重点实验室（湖北十堰 44000）

神经胶质细胞瘤是最常见的颅内肿瘤，具有高发病率、高致死率等特点［1-2］。患者接受手术与化疗后的中位生存时间仅2～3年。由于神经胶质瘤所具有细胞结构混杂、弥漫性的侵袭力、高耐药性等特性，给研究者带来了巨大的挑战［3］。因此，急需开发安全高效的脑胶质瘤治疗新方法，而生物治疗是最有前景的方案之一。

基因治疗是非常有潜力的生物治疗方法之一。自MSCs的肿瘤归巢性被发现后，以抗癌基因编辑MSCs介导治疗肿瘤的研究越来越受到人们关注［4］。我们前期研究利用MSC介导的单一TRAIL［5］或 PTEN［6］基因均可促进胶质瘤细胞凋亡，但局限于携带单一抗癌基因所进行的肿瘤靶向治疗的研究，在面对肿瘤多变性与个体差异性情况下，难以获得良好的治疗效果。为解决单基因抵抗问题，我们选取通过外源性通路导致肿瘤细胞凋亡的TRAIL基因和通过内源性通路导致细胞凋亡的PTEN基因组合作，构建MSC介导的双基因共表达系统作用于脑胶质瘤，来研究其对胶质瘤细胞的杀伤作用。

传统的基因编辑载体如病毒、DNA载体等由于转染效率低及可能引起基因重组、突变等问题限制其临床应用［7］。近年来，一种新的安全高效体外合成mRNA的基因治疗方法吸引着研究者们的目光［8］。利用体外合成mRNA的方法已广泛应用于在多能干细胞或体细胞的编程及诱导分化等方面［9-10］。

本文将采用体外制备TRAIL及PTEN基因的mRNA，共转染入MSC中，使两种抗癌蛋白共表达，协同高效杀伤脑胶质瘤细胞。本研究将为开发高效、安全的的脑胶质瘤基因治疗提供策略，为今后的临床应用多基因联合靶向治疗疾病打下基础。

1 材料与方法

1.1 细胞和培养条件 MSCs从人的胰腺组织内分离得到，体内增殖扩增的方法如前所述［11］。人神经胶质瘤细胞DBTRG⁃LUC购自ATCC，严格按照ATCC建议方法培养，其培养条件与MSCs保持一致。

1.2 PTEN-与TRAIL⁃mRNA体外合成 体外RNA合成过程如图1A所示，人5′UTR的Kozak序列和3′UTR序列由公司合成，克隆到pcDNA3.3载体后命名为pcDNA 3.3⁃TOPOTA载体。限制性内切酶切开质粒后作为tail PCR的模板。利用MEGAscript T7试剂盒合成，将ARCA帽子类似物、三磷酸腺苷、GTP、5⁃甲基胞嘧啶和假尿嘧啶等37℃孵育5 h后，再用碱性磷酸酶37℃处理2 h去除5′⁃三磷酸。合成的RNA用Ambion MEGA clear spin columns纯化然后测定浓度后保存使用。

1.3 PTEN-与TRAIL⁃mRNA转染MSCs表达检测 按TransIT⁃mRNA说明书操作，将mRNA用Opti⁃MEM基础培养基稀释，然后将Boost reagent和TransIT⁃mRNA试剂依次按顺序加入上步溶液中，室温孵育2 min后，加入含完全培养基的培养皿内。培养皿置于培养箱内，分别于6和12 h后检测基因的表达情况。成功转染相应mRNA的MSCs分别命名为MSC⁃TRAIL，MSC⁃PTEN和MSC⁃T+P。

1.4 间接共培养的方法检测肿瘤细胞的活力0 d时，将DBTRG⁃LUC细胞以5 × 103个/孔的密度接种于96孔板中。1 d时将96孔板中培养基换为从 MSCs（CM）或转染 PTEN mRNA、TRAIL mRNA或者共转MSC的条件培养基（CM）（CM⁃PTEN、CM⁃TRTIL、CM⁃TRTIL/PTEN），按0%、25%、50%、75%和100%CM5种浓度梯度分别加入到100 μL MEM完全培养基中继续培养。在第0、3、6天时利用小鼠活体成像仪检测发光强度。

1.5 transwell共培养系统检测MSCs的迁移能力 将DBTRG⁃LUC细胞按1×105个/孔接种到24孔板内，将野生型 MSCs、MSC⁃TRAIL、MSC⁃PTEN或MSC⁃TRTIL/PTEN用无血清的培养基混匀加到transwell小室的微孔膜上。培养48 h后，95%乙醇固定小室，0.1%结晶紫染色。100×显微镜下分别随机选取5个视野记数穿过的细胞数。将上述的DBTRG⁃LUC细胞换为野生型MSCs重复实验作为正常细胞的移能力对照。

1.6 荧光显微镜分析 0 d，将DBTRG⁃LUC细胞按1×105个/孔的密度接种到24孔板内。1 d时，将原培养基换为50%或者100%的CM。4 d时加入新鲜配置的工作液（含1 μmol/L calcein AM和2 μmol/L EthD⁃1，250 μL/孔）置于暗室中孵育 10 min。ImageJ处理分析荧光显微镜观察的图片。

1.7 统计学方法 利用SPSS 10统计学软件，组间差异用两样本均数t检验，率的比较用χ2检验，以P＜0.05表示差异有显著统计学意义。

2 结果

2.1 PTEN-与TRAIL⁃mRNA的体外合成及鉴定 mRNA合成流程如图1A所示，以前期构建载体为模板构建具有分泌型信号肽的PTEN和TRAIL mRNA合成载体利用GFP⁃mRNA为对照检测mRNA转染效率，结果显示GFP⁃mRNA转染MSCs效率可高达98.6%（图1B）。与对照组对比转染组细胞中TRAIL和PTEN的蛋白表达量明显增多，在培养基中也能检测到分泌形式的TRAIL和PTEN蛋白（图1C）。

2.2 转染TRAIL、PTEN mRNA对MSCs迁移能力影响 经过48 h的间接共培养，transwell结果显示，与野生 MSCs对比 TRAIL⁃和 PTEN⁃mRNA 的转染并没有降低MSCs向DBTRG细胞的迁移能力（图2A），反而MSC⁃TRAIL、MSC⁃PTEN和MSC⁃TRAIL/PTEN的迁移能力明显的增强（图3C）。而对照组（小室底部没有铺DBTRG⁃LUC细胞）中以上各组细胞并未迁移（图2B）。

活体成像仪检测结果如图3a所示，随着CM比例提高和培养时间延长，DBTRG⁃LUC细胞的荧光强度逐渐降低。在CM（25%）时，共培养6 d后，DB⁃TRG⁃LUC细胞死亡率均显著增高（P＜0.05）（图3b1）；在共培养的第3天，CM（75%）的CM⁃TRTIL、CM（50%）的CM⁃PTEN和CM（25%）的CM⁃TRTIL/PTEN时已经开始有细胞死亡（P＜0.05）（图3b2～4）。然而，RTCA实验的结果显示在加入CM 20 h后就对DBTRG⁃LUC细胞活力有影响（图4）。

图1 mRNA的体外合成与转染表达情况Fig.1 mRNA synthesis and in vitro expression in MSCs

图2 Transwell检测MSCs迁移能力Fig.2 In vitro migratory ability of MSCs

利用LIVE/DAED Viability/Cytotoxicity Assay Kit分析CM对DBTRG⁃LUC细胞致死作用，在50%和100%CM培养DBTRG⁃LUC细胞4 d后，与正常MSC细胞的CM对比CM⁃PTEN、CM⁃TRTIL及CM⁃TRTIL/PTEN能显著引起DBTRG⁃LUC细胞死亡（图5）。

图3 DBTRG⁃LUC细胞活力检测Fig.3 Assessment of DBTRG cell viability using bioluminescence determination

图4 利用RTCA实时分析CM对DBTRG细胞的杀伤作用Fig.4 Real⁃time assessment of conditioned medium（CM）⁃induced cytotoxicity in DBTRG cells

3 讨论

恶性胶质瘤很难治愈，主要是由它的生长位置和容易迁移侵袭的特性决定的［12］。自从MSCs的肿瘤趋向性被发现以来，利用特定抗癌基因编辑的MSCs已逐渐成为最有潜力的靶向治疗胶质瘤方法。然而，用病毒或质粒载体携带抗癌基因的MSCs不能应用于临床治疗。

最新的体外合成mRNA方法，是一种安全高效的基因治疗方法，它可完全排除对宿主基因的修饰，并已被证实可应用于临床研究［13］。因此，利用体外合成特定抗癌基因mRNA编辑MSCs的方法具有临床应用价值。

肿瘤坏死因子相关的凋亡诱导配体（TARIL）基因可以通过激活死亡受体促使肿瘤细胞凋亡而又不损伤正常细胞［14］，这使其成为抗肿瘤药物结合的潜在靶点。几乎所有脑胶质瘤患者都伴有PTEN基因表达活性的低下，高达40%的脑胶质瘤是由PTEN基因突变所致，以增强PTEN基因表达活性为手段的抗癌研究一直受到广泛的关注［15］。鉴于此，我们体外合成能表达分泌TARIL、PTEN蛋白的mRNA，并用它们分别编辑MSC应用于治疗癌症研究，探讨它潜在的临床应用价值。

如图1所示，体外合成的mRNA均得到了正确表达具有分泌性蛋白。并且体外合成的TARIL、PTEN mRNA不仅没有降低MSCs的迁移能力，反而大大增加了它们对DBTRG细胞的迁移作用（图2）。通过间接共培养方法发现，DBTRG细胞对CM⁃PTEN和CM⁃TRTIL非常敏感，用很低浓度的CM就可以在短时间内造成DBTRG细胞大量死亡，并且PTEN和TRAIL⁃mRNA联合应用效果更明显（图3～4）。以上结果提示当单独应用一种mRNA对肿瘤杀伤效果不明显时，联合应用多种mRNA也是提高疗效的一种手段。

本研究利用体外合成抑癌基因TRTIL、PTEN mRNA修饰MSC作用于胶质瘤细胞，首次成功开拓了一种高效、安全、可靠双基因共表达系统治疗肿瘤新方法，为后期体内研究和临床应用治疗肿瘤提供了一种全新思路。然而TRTIL、PTEN双基因共表达系统的高效杀伤肿瘤细胞的作用机制目前不是很清楚，以及在体内双基因表达系统作用是否优于单基因作用效果，还需要进一步研究。

图5 间接共培养分析DBTRG⁃LUC的活力检测Fig.5 DBTRG⁃LUC cell viability of indirect co⁃cultures

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