BIM 缺失多态性与乳腺癌紫杉醇内源性耐药机制的关系

梁红玲 黄健清 金田恩 李洪胜 姜明 陈忠生 兰卉 谭小军

1广州医科大学附属肿瘤医院（广州 510095）；2广州医科大学（广州 510006）；3广州达安临床检验中心（广州 510520）

乳腺癌是全球女性发病率及病死率最高的恶性肿瘤，耐药是其居高不下的重要原因之一［1-2］。BIM（Bcl⁃2 interacting mediator of cell death）是 Bcl⁃2家族成员之一，在乳腺癌、肺癌、骨肉瘤和黑色素瘤中具有促进细胞凋亡的作用［3-4］。近期发现BIM缺失多态性与EGFR（+）NSCLC等肿瘤靶向抑制剂的疗效不佳相关［5］。随后，更多的研究发现BIM缺失多态性是非小细胞肺癌、慢性粒细胞白血病、急性粒细胞白血病以及乳腺癌不良预后的肿瘤分子标志物［6-10］。然而，BIM缺失多态性与乳腺癌紫杉醇内源性耐药机制的研究鲜见相关报道。本实验将筛查出BIM缺失多态性人乳腺癌细胞株，测定其紫杉醇药物的敏感性以及检测BIM在乳腺癌细胞中mRNA及蛋白水平的表达情况，探讨BIM缺失多态性与乳腺癌紫杉醇内源性耐药机制的关系。

1 材料与方法

1.1 细胞株和主要试剂 本研究所用人乳腺癌细胞株（MCF7、MDA⁃MB⁃231、MDA⁃MB⁃435、T47D）及肺癌细胞株（HCC2279）均为广州医科大学附属肿瘤医院肿瘤研究所细胞库储存。RPMI1640培养基（美国Gibcol公司）；胎牛血清、胰蛋白酶（BioInd公司）；紫杉醇（Selleck.cn）；MTS试剂及细胞冻存的DMSO（美国Sigma⁃Aldrich公司）；PCR试剂盒、rtPCR试剂盒（Takara公司）；b⁃Actin（13E5）Rabbit mAb、Bim（C34C5）Rabbit mAb（Cell signaling Tec。）。

1.2 细胞培养 将人乳腺癌细胞株（MCF7、MDA⁃MB⁃231、MDA⁃MB⁃435、BT549）及肺癌细胞株（HCC2279）用完全培养基（RPMI 1640+10%FBS）于T25的培养瓶中37℃，5%CO2培养箱中培养。每2～3天更换一次培养液，细胞处于对数生长期时可用于实验使用。

1.3 检测细胞株中BIM缺失多态性 运用DNA/RNA/Protein Isolation Kit（Omega，Cat R6734）提取各细胞株中的总DNA/RNA/Protein，再通过PCR技术（Takara，RR030A）扩增目的基因并进一步行基因测序明确目的条带。PCR引物设计：野生型：上游引物5′⁃CCACCAATGGAAAAGGTTCA⁃3′，下游引物 5′⁃CTGTCATTTCTCCCCACCAC⁃3′，缺失型：上游引物与野生型相同，下游引物5′⁃GCACAGCCTC⁃TATGGAGAA⁃3′。反应条件：98 ℃预变性2 min，98℃变性10 s，55℃退火30 s，72℃延伸30 s，进行35个循环，72℃7 min终延伸，4℃取出。

1.4 rtPCR检测细胞株的BIM mRNA 吸取上述各细胞株中提取的总RNA，测定RNA纯度及含量。使用Takara逆转录试剂盒（Takara，RR047A）逆转mRNA为cDNA。rtPCR扩增以cDNA为模板，按照试剂（Takara，RR420A）说明书进行BIM EX⁃ON3及EXON4变体表达量的测定。PCR引物设计：EXON3：上游引物 5′⁃CAATGGTAGTCATCCT⁃AGAGG⁃3′，下游引物5′⁃GACAAAATGCTCAAGGA⁃AGAGG⁃3′，EXON4：上游引物 5′⁃TTCCATGAGGC⁃AGGCTGAAC⁃3′，下游引物5′⁃CCTCCTTGCATAGT⁃AAGCGTT⁃3′，EXON2（内参）：上游引物5′⁃ATGG⁃CAAAGCAACCTTCTGATG⁃3′，下游引物5′⁃GGCTC⁃TGTCTGTAGGGAGGT⁃3′。反应条件：98 ℃预变性2 min，98℃变性10 s，62℃退火20 s，72℃延伸30 s，进行35个循环，72℃7 min终延伸，4℃取出。

1.5 Western Blot检测细胞株的功能性BIM蛋白 吸取上述各细胞株中提取的总蛋白，经Nano⁃Drop ND⁃2000超微量分光光度计测定蛋白浓度后加上样缓冲液并于沸水使蛋白变性。采用SDS⁃PAGE电泳的方式分离目标蛋白，随后通过蛋白转印仪半干转法（25 V，3 A，7 min）将其转至PVDF膜。以含5%脱脂牛奶TBST液封闭，再孵育一抗摇床过夜。次日，分别经过洗膜、荧光二抗孵育、再次洗膜后，于Odyssey CLx近红外双色激光成像系统曝光。

1.6 MTS测定细胞株的紫杉醇IC50收集对数期细胞，调整细胞悬液浓度为50 000个/mL，每孔加入100 μL细胞悬液（每孔5 000个细胞），置于培养箱培养，待贴壁后第2天，加入100 μL用含10%血清的培养基配制的不同浓度梯度的化疗药物（紫杉醇）。继续培养72 h后，每孔加入20 μL⁃MTS（5 mg/mL），培养3～4 h后终止培养。随后通过检测吸光值，确定各细胞株对药物的IC50值。

1.7 统计学方法 应用统计学软件SPSS 17.0进行统计分析。实验重复3次以上，数据均以均数±标准差表示。两两比较采用Student′st检验。P＜0.05定义为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 人乳腺癌细胞株中BIM缺失多态性的突变情况 T47D与HCC2279均具有BIM缺失多态性（PCR产物为285及363 bp），与文献报道肺癌细胞株HCC2279的检测结果相一致［5］。而MCF7、MDA⁃MB⁃231、MDA⁃MB⁃435则为BIM野生型乳腺癌细胞株（PCR产物为363 bp）（图1）。

图1 BIM缺失多态性PCR（A）与基因测序检测结果（B）Fig.1The PCR detection result（A）and direct sequencing result（B）of Bim deletion polymorphism

2.2 BIM mRNA及功能性BIM蛋白在乳腺癌细胞株的表达情况 乳腺癌细胞株中（MCF7、MDA⁃MB⁃231、MDA⁃MB⁃435、T47D），BIM mRNA EXON3：EXON4比值在T47D（BIM突变型）中比值较高，而在其余细胞株中则比值较低（P＜0.05，图2A）。与此同时，功能性 BIM 蛋白（BimEL、BimL、BimS）在T47D（BIM突变型）中表达下调，而在其余细胞株中则有较高水平的表达（P＜0.05，图2 B）。

2.3 BIM缺失多态性与紫杉醇敏感性的关系 本研究选用了乳腺癌常见的Luminal A型（ER、PR阳性，HER⁃2阴性）的T47D（BIM突变型）、MCF⁃7（BIM野生型）乳腺癌细胞株作为实验模型［11-12］。结果示BIM突变型细胞株（T47D，IC50＞30 μmol/L）相对野生型细胞株［MCF⁃7，IC50=（0.16 ± 0.02）μmol/L］对紫杉醇药物敏感性显著较低，且具有统计学差异（P＜ 0.05，图3）。

图2 各乳腺癌细胞株BIM mRNA EXON3：EXON4比值（A）与功能性BIM蛋白的表达情况（B）Fig.2 The ratio of BIM EXON3 to EXON4（A）and the levelof functional BIM protein（B）in breast cancer cell lines

2.4 BIM缺失多态性与紫杉醇内源性耐药机制的关系 在相同紫杉醇浓度作用下，伴随时间的变化，采用rtPCR测定BIM mRNA EXON3：EXON4比值。结果示T47D（BIM突变型）EXON3：EXON4比值随紫杉醇作用时间变化而逐渐增大，MCF⁃7（BIM野生型）则逐渐减小（P＜0.05，图4 A）。同时，在相同时间不同浓度紫杉醇作用下，Western Blot测定T47D的功能性BIM蛋白（BimEL）的表达较MCF⁃7逐渐减少（P＜0.05，图4 B）。

3 讨论

BIM是Bcl⁃2家族成员之一，属于BH3⁃only蛋白，是参与调节细胞凋亡的重要介质［13-14］。近期，Ng等通过末端测序技术筛查CML患者的基因组时发现，BIM在2号内含子中发生了2 903个碱基对的缺失，且该现象在非小细胞肺癌和慢性髓细胞白血病中与酪氨酸激酶抑制剂内源性耐药机制密切相关［5］。随后，在乳腺癌及其多种肿瘤类型中发现BIM缺失多态性为不良预后的预测因子［6-10］。本研究通过筛查，首次发现了BIM缺失多态性乳腺癌细胞株T47D，且其突变类型与文献报道的肺癌细胞株（HCC2279）相一致［5］。同时，MTS测定结果示，同为Luminal A型的T47D细胞株（BIM突变型）较MCF7细胞株（BIM野生型）对紫杉醇敏感性显著较低。这表明BIM缺失多态性可能参与了紫杉醇的内源性耐药机制。最近的研究发现，BIM缺失多态性会使得BIM在转录后选择性剪切的过程中更倾向于剪切EXON3（编码终止子/多聚A尾）而非EXON4（编码BH3同源结构域），导致其所编码翻译的蛋白质产物Bimγ中只含有动力蛋白结合区域，却缺失BH3同源结构域和C端疏水序列，然而BH3同源结构域是BH3⁃only蛋白中发挥促凋亡作用的重要结构基础［5，15-17］。而在本研究的rtPCR及Western Blot结果中，T47D（BIM突变型）较其他野生型细胞株，BIM mRNA EXON3：EX⁃ON4比值高且功能性BIM蛋白表达下调。与此同时，相对MCF7（BIM野生型）而言，在紫杉醇作用下T47D（BIM突变型）BIM mRNA EXON3：EXON4比值随时间的推移逐渐增高，而功能性BIM蛋白（BimEL）则逐渐下调。该现象表明，BIM缺失多态性在乳腺癌紫杉醇内源性耐药机制中的作用可能与Ng等在非小细胞肺癌中的推断是相一致的。BIM缺失多态性在乳腺癌中可通过影响BIM mRNA选择性剪切的过程，致使转录出大量含有EXON3的BIM mRNA，进而翻译出无功能性的BIM蛋白（Bimγ），从而削弱了内源性凋亡途径的作用，使得乳腺癌肿瘤细胞对紫杉醇的敏感性降低，导致内源性耐药的发生。其次，最近的研究发现BH3模拟剂（ABT⁃737 or ABT⁃263）［5］和HDAC抑制剂（Vorinostat）［18］具有逆转BIM缺失多态性所致内源性耐药的作用。前者是模拟了Bad的BH3结构域，而后者则是通过介导启动子区域的组蛋白乙酰化，促进BH3⁃only蛋白的转录和表达，从而克服耐药发生。其机制都是通过增强BH3⁃only蛋白（Bim、Bid、Bad、Bik）的作用来促进内源性凋亡途径，侧面也论证了BIM缺失多态性可能是通过削弱内源性凋亡途径，从而介导内源性耐药机制的发生。

综上所述，BIM缺失多态性可能与乳腺癌紫杉醇内源性耐药机制密切相关。然而，本研究为细胞体外实验，且相关研究较少，其结论仍有待细胞动物实验及临床观察的进一步论证。

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