辐照剂量对肿瘤细胞活性及肿瘤融合细胞疫苗效果的影响

于亚婷 段斯亮 马新博 申海光 刘云 姜伯劲 周盛 肖立兵 韦丽华

广西科技大学医学院1病原生物学与免疫学教研室，2病理学教研室（广西柳州545005）

肝癌是常见的恶性肿瘤之一，临床进程发展迅速，预后不良。目前，肝癌的传统治疗手段主要是手术切除、化疗，放疗等［1-2］，然而，这些治疗方法给患者的生活质量带来了严重的影响，因此，如何更好地预防或治疗肝癌是迫切需要解决的问题。

以肿瘤细胞和同种树突状细胞（dendritic cell，DC）的融合细胞制备而成的肿瘤疫苗，因其具备很好的免疫原性，成为针对恶性肿瘤治疗开发的新一代治疗性肿瘤疫苗［3-4］。WENG等［5］在慢性淋巴细胞白血病的研究中，对于肿瘤细胞裂解物致敏DC、DC负载凋亡肿瘤细胞和融合细胞这三者进行了比较，发现只有融合细胞表现出最强的诱导能够发挥细胞毒性的T淋巴细胞的能力。GONZÁLEZ等［6］比较了融合疫苗和裂解物或是肽来源的DC疫苗，发现融合疫苗能够刺激机体产生更多肿瘤特异性T细胞，从而使得机体IFN⁃γ水平升高更加明显。由此可见，DC/肿瘤融合细胞疫苗在刺激机体抗肿瘤方面具有其自身独特的优势。

如何制备安全高效的融合细胞疫苗依旧是融合细胞疫苗发展和应用道路上一个需要探讨和解决的问题。目前，制备融合细胞疫苗的常用方法是聚乙二醇（polyethylene glycol，PEG）诱导融合法［7-9］。采取PEG融合法进行融合细胞疫苗的制备费用较电融合法较低［10-12］。为了提高融合细胞疫苗安全性，常需采用辐照的方法对肿瘤细胞或者肿瘤融合细胞进行照射［13-14］。为此，笔者在本实验的研究中，探讨了辐照剂量对肿瘤细胞活性的影响，并制备安全高效的融合细胞疫苗实现更强的杀伤肝癌细胞的效果，为肿瘤细胞疫苗制备奠定了坚实的基础。

1 材料与方法

1.1 动物和细胞 4～6周龄雌性BALB/c小鼠，购买于北京维通利华有限公司。鼠肝癌细胞系BNL 1ME a.7R.1（MEAR）细胞购买于上海生物细胞库。T淋巴细胞与DC分别取自小鼠的脾脏和骨髓。

1.2 主要试剂 PEG（美国，Sigma Aldrich），PKH⁃26（美国，Sigma Aldrich），Annexin V/PI凋亡检测试剂（瑞士，Roche）。

1.3 主要仪器 生物安全柜（苏净集团，苏州安泰空气技术有限公司），CO2细胞培养箱（上海三腾仪器有限公司），超低温冰箱（中国海尔公司），RS2000生物学X射线辐照仪（美国Rad Source公司），流式细胞仪（美国贝克曼公司），倒置显微镜（上海巴拓仪器有限公司）等。

1.4 实验方法

1.4.1 细胞培养方法 用1640培养基（含100 U/mL青霉素，100 μg/mL链霉素和10%FBS），进行细胞培养。细胞置于37℃，5%CO2培养箱中培养。

1.4.2 细胞辐照方法 辐照的前1天将细胞接种到培养瓶中，接种量为3×105个/瓶。直接在25 cm2的培养瓶中进行X射线的辐照。辐照仪为RS 2000生物学X射线辐照仪。辐照电流为16 mA，电压为250 kV。辐照剂量为：5、10、20、40、60 Gy；并设置空白对照组，不进行辐射。剂量率为1 Gy/min。

1.4.3 细胞活性检测 将接受不同辐照剂量的细胞接种于平板，通过统计细胞克隆形成数，进行细胞活性检测。细胞接种存活率即为细胞克隆形成率，表示接种的贴壁细胞后存活并形成克隆的数量，从而反映细胞的群体依赖性和增殖的能力。具体方法为：用胰酶将接受不同辐照剂量的细胞分别消化下来，计数，然后调整细胞悬液至适宜浓度，再分别接种到相应的培养皿中，在5%CO2、饱和湿度的培养箱内，37℃培养1周左右，固定、染色并干燥。统计细胞的克隆数，每个剂量设3个皿作为重复。最后，计算出细胞克隆的形成率，得出不同剂量辐照以后的肿瘤细胞活性情况。计算公式：克隆形成率=（克隆数/接种细胞数）×100%。细胞存活分数=（受照细胞克隆形成率/对照细胞克隆形成率）×100%。

1.4.4 细胞融合方法 收集培养5 d的原代DC及经20、60 Gy照射的MEAR细胞，细胞计数。按DC与MEAR之比为2∶1，涡旋混匀细胞，离心后弃上清，弹匀细胞，于40℃水浴。取300 μL PEG缓慢加入离心管中。缓慢沿管壁加入一定量的PBS，轻摇离心管至混匀，离心1 500 r/min，10 min。用含完全1640培养基重悬细胞，置于37℃、5%CO2培养箱培养。

1.4.5 流式检测不同辐照剂量下DC/MEAR融合细胞疫苗体外对MEAR细胞的杀伤作用 将分离好的淋巴细胞与20、60 Gy辐照剂量下DC/MEAR融合细胞疫苗按10∶1的比例混匀后，于37℃，5%CO2培养箱中培养约1周。收集一定数量的MEAR细胞，PBS洗1次，离心后进行PKH⁃26染色。收集经融合细胞疫苗刺激后的T淋巴细胞，按效靶比10∶1铺板。孵育4～6 h后，收集上述细胞，PBS洗1次，进行PI染色。染色完毕，进行流式检测。按以下公式计算细胞的凋亡率，并比较各实验组MEAR细胞的凋亡情况。MEAR细胞的凋亡率=100%×（实验孔的凋亡率-自然释放孔的凋亡率）/（100-自然释放的孔凋亡率）。

1.5 统计学方法 利用Graph pad软件进行统计学分析，两组之间的比较应用LSD检验法，多组数据之间的比较应用F检验法。

2 结果

2.1 辐照剂量对肿瘤细胞活性的影响 经不同剂量的X射线辐照以后，MEAR细胞的细胞克隆数随着辐照剂量的上升而减少（图1）。通过对所取得的数据点进行拟合，可得到MEAR细胞的存活曲线（图2）。细胞的存活曲线描述了细胞的存活分数与辐照剂量之间的关系。我们得出，当辐照剂量约为20 Gy时，细胞存活分数为50%；当辐照剂量为60 Gy的时候，细胞的存活分数较低。

2.2 辐照剂量对融合细胞疫苗效果的影响 应用PKH⁃26/PI的方法检测不同辐照剂量（20和60 Gy）下制备的融合细胞疫苗，刺激T淋巴细胞，对MEAR细胞的杀伤效果的比较。用PKH⁃26进行MEAR细胞的标记。MEAR细胞的平均凋亡率为18.1%、38.0%。20 Gy组DC/MEAR诱导活化的T细胞对靶细胞MEAR杀伤率高于60 Gy组（图3）。两组结果差异有统计学意义（P＜0.05，图4）。杀伤实验结果提示，融合细胞疫苗能刺激产生MEAR特异性T淋巴细胞（CTL），且20 Gy组DC/MEAR诱导活化的T淋巴细胞对MEAR细胞的杀伤活性更强。

图1 经不同剂量的X射线辐照后MEAR细胞克隆数随辐照剂量增加而减少Fig.1 The number of MEAR cell clones were decreased with the increasing of X⁃Ray irradiation dose

图2 经不同剂量的X射线辐照以后，MEAR细胞存活分数随着辐照剂量的增加而减少Fig.2 The survival percent of MEAR cells was decreased with the increasing of X⁃Ray irradiation dose

图3 不同辐照剂量下制备的融合细胞疫苗刺激产生的T淋巴细胞，对MEAR细胞的杀伤效果不同Fig.3 The killing effects of T lymphocytes，which were stimulated by different fusion cell vaccines，to MEAR cells was not the same.These fusion cell vaccines were made from distinct dose irradiated tumor cells

图4 DC/MEAR⁃T（60 Gy）组和DC/MEAR⁃T（20 Gy）组T淋巴细胞对MEAR细胞的杀伤效果比较Fig.4 mDC/MEAR⁃T（60 Gy）group and DC/MEAR⁃T（20 Gy）group were significantly different in aspect of T lymphocytes′killing effects to MEAR cells

3 讨论

DC/肿瘤融合细胞疫苗的最大优势在于其无需鉴定已知和未知的肿瘤抗原和肿瘤基因，也无需明确肿瘤抗原和肿瘤基因的特异性和非特异性。DC/肿瘤融合细胞疫苗既保持了DC递呈抗原的特点，又保持了肿瘤细胞作为免疫原的性质，DC通过其表面的MHC⁃I和MHC⁃II类分子递呈已知或未知的肿瘤抗原，进而诱导肿瘤特异性T细胞，发挥免疫效应［15-16］。至今，关于辐照剂量对细胞存活的影响的研究并不多，但是，已有一些报道阐述了关于单次照射和分次照射对细胞存活的影响。科学家认为，单次大剂量辐照可能会导致细胞结构发生变化，产生不可修复的损伤。我们猜测，对肿瘤细胞进行适当剂量的辐照，能够在保证其免疫原性不被破坏的同时，使其丧失大量增殖的能力，从而提高了肿瘤融合细胞疫苗的安全性。本实验为探索不同辐照剂量下用于制备融合疫苗的肿瘤细胞存活情况，发现肿瘤细胞存活分数降低，这可能是与肿瘤细胞经辐照后结构损伤有关。这样经过大剂量辐照的肿瘤细胞只具有免疫原性，不具有增殖活性，但是，过高的剂量会使肿瘤细胞免疫原性降低，所以，以合适的剂量对肿瘤细胞照射，从而制备的肿瘤融合细胞疫苗具备安全高效的特性，这个探索不仅为DC/肿瘤融合细胞疫苗的制备提供了参考依据，同时，也为DC/肿瘤融合细胞疫苗的临床应用提供了广阔前景。当然，对于辐照剂量如何影响肿瘤细胞活性，进而影响肿瘤融合细胞疫苗效果的机制还有待进一步研究。

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