经后增殖方对超排卵大鼠卵巢颗粒细胞Fas 通路的影响

陈艳婷 郭新宇 袁秋虹 邓伟民

1广州军区广州总医院内六科（广州510010）；2广州中医药大学（广州510405）；3广州军区广州总医院辅助生殖中心（广州510010）

子宫内膜容受性与胚胎质量是体外受精-胚胎移植（IVF⁃ET）成功与否的两个重要条件。研究证实，IVF⁃ET过程中控制性超排卵（controlled ovarian hyperstimulation，COH）可能从一定程度损害卵母细胞染色体的结构和功能，进而影响胚胎基因表达，降低胚胎质量及着床潜能，但其具体机制尚不明确。现代医学对如何改善超排卵胚胎质量尚未获得普遍公认的研究成果，传统中医学对此做了很多有意义的探索［1-2］，但大都局限于子宫内膜容受性的研究，且多为临床现象的观察。本课题组前期研究提示经后增殖方在相同子宫内膜容受性的基础上提高了胚胎本身的着床能力［3］，结合该方的方药分析，我们认为其可能是通过改善卵母细胞质量而提高胚胎本身的种植能力，并通过动物实验证实了该方可改善COH状态下卵母细胞质量，提高卵母细胞发育潜能，从而促进胚胎种植。Fas通路是经典细胞凋亡通路之一，在人体大多数器官广泛存在，可介导多种组织细胞凋亡。本实验在前期研究的基础上，将中药经后增殖方与IVF⁃ET技术结合进行系统的动物实验研究，通过测定Fas通路上关键凋亡因子Fas、Fasl、Caspase⁃8、Caspase⁃3在卵巢组织中的表达，旨在进一步探讨中药改善卵母细胞质量的可能作用机制，为在COH过程中早期中药干预，从而改善卵泡质量，提高妊娠率提供实验依据，现报告如下。

1 材料与方法

1.1 实验材料

1.1.1 实验用药、试剂与仪器 醋酸曲普瑞林（GnRHa，瑞士辉凌公司，批号：K18565B）；注射用血促性素（又名孕马血清促性腺激素，杭州动物药品厂，批号：110204564）；人绒毛膜促性腺激素（HCG，丽珠药业有限公司，批号：160201）；经后增殖方（颗粒剂，1包，相当于生药：党参15 g，白术12 g，茯苓12 g，甘草6 g，熟地黄12 g，白芍12 g，当归6 g，川芎6 g，菟丝子15 g，鹿角霜20 g，杜仲15 g，山萸肉10 g，川椒3 g。广东一方制药厂，批号：Q1704009）。FAS一抗（Abcam公司），FASL一抗（Affinity Biosciences），Caspase8一抗（Abcam公司），Caspase3一抗（Santa Cruz公司），山羊抗兔IgG（Jackson公司），BCA蛋白定量试剂盒（杭州弗德生物科技有限公司），预染蛋白Marker（Fermantas公司），ECL发光液（杭州弗德生物科技有限公司），逆转录试剂盒（DBI公司），荧光定量PCR检测试剂盒（Genecopoeia公司），荧光定量PCR仪（ABI公司），微量核酸定量仪（Merinton公司）。

1.1.2 实验动物及分组 SPF级SD雌性大鼠30只，鼠龄6～8周，体质量180～220 g，由本院动物实验中心提供，合格证号：44002100011623。适应性饲养1周后进入实验阶段，自由取水和摄食，以阴道脱落细胞涂片检查动情周期（阴道涂片全为无核角化细胞，间或有少量上皮细胞）。使用Ex⁃cel软件随机分为3组：空白组、阳性组、中药组，每组10只。中药组和阳性组于阴道涂片为动情后期（动情周期第3天）时，每日9：00 am腹腔注射醋酸曲普瑞林20 μg/kg，连续9 d，第9天同时腹腔注射孕马血清400 U/kg，48 h后腹腔注射人绒毛膜促性腺激素（hCG）1 000 U/kg。空白组每日给予等体积生理盐水腹腔注射。中药组每日给予临床等效剂量的经后增殖方灌胃（1.5 mg/kg），阳性组与空白组以等体积生理盐水灌胃。

1.1.3 标本取材 腹腔注射HCG 2 h后颈椎脱臼处死大鼠，快速取出双侧卵巢，经液氮速冻5 min后置于-80℃冰箱冻存。

1.2 实验方法

1.2.1 qPCR检测 qPCR检测卵巢组织中Fas，Fasl，Caspase⁃8，Caspase⁃3 mRNA的相对表达量按照试剂盒说明书进行PCR反应，制作标准曲线，根据标准曲线扩增效率的一致性，用2-ΔΔCt法分别计算 Fas，Fasl，Caspase⁃8，Caspase⁃3 mRNA 的相对表达量。引物序列及PCR产物大小见表1。

表1 qPCR引物序列Tab.1 Sequences of PCR primer

1.2.2 Western⁃blot检测 Western blot检测卵巢组织中 Fas，Fasl，Caspase⁃8，Caspase⁃3 蛋白的表达取适量卵巢组织提取总蛋白溶液，按照BCA蛋白定量试剂盒说明测定各组蛋白浓度。采用Image J软件处理系统分析目标带的光密度值（OD）。分别以 Fas/β⁃actin，Fasl/β⁃actin，Caspase8/β⁃actin，Cas⁃pase3/β⁃actin的相对OD值表示结果。

1.3 统计学方法 采用SPSS 19.0进行统计学分析，数据以均数±标准差表示。多组间比较用单因素方差分析，组间的多重比较采用LSD分析。P＜0.05为差异具有统计学意义。

2 结果

2.1 3 组大鼠卵巢组织中 Fas，Fasl，Caspase⁃8，Caspase⁃3 mRNA相对表达量比较 3组大鼠卵巢组织中 Fas，Fasl，Caspase⁃8，Caspase⁃3 mRNA 相对表达量阳性组即控制性超排卵组较空白组和中药组 Fas，Fasl，Caspase⁃8，Caspase⁃3 mRNA 的转录水平增高，其中，空白组与阳性组具有显著差异（分别为P=0.000，P=0.000，P=0.000，P=0.002）。中药组Fas，Fasl，Caspase⁃8 mRNA转录水平与阳性组相比差异具有显著性（分别为P=0.000，P=0.008，P=0.000），但Caspase3 mRNA表达水平与阳性组无统计学意义（P=0.078）。中药组Fas，Fasl，Caspase⁃8，Caspase⁃3 mRNA相对表达量与空白组之间差异无统计学意义（P＞0.05）。见图1。

2.2 3 组大鼠卵巢组织中 Fas，Fasl，Caspase⁃8，Caspase⁃3蛋白表达量比较 3组大鼠卵巢组织中Fas，Fasl，Caspase⁃8，Caspase⁃3 蛋白的表达阳性组经超促排卵干预后 Fas，Fasl，Caspase⁃8，Caspase⁃3蛋白表达较空白组和中药组增高，其中空白组与阳性组相比差异具有显著性（分别为P=0.004，P=0.003，P=0.001，P=0.008）。中药组Caspase⁃3蛋白表达较阳性组下降，但差异无统计学意义（P=0.110），中药组Fas，Fasl，Caspase⁃8表达与阳性组相比差异具有统计学意义（分别为P=0.046，P=0.048，P=0.042）。中药组 Fas，Fasl，Caspase⁃8，Caspase⁃3蛋白表达高于空白组，但差异无统计学意义（P＞0.05）。见表2、图2。

图 1 3组大鼠卵巢组织中Fas，Fasl，Caspase⁃8，Caspase⁃3mRNA相对表达量比较Fig.1 Expression of Fas，Fasl，Caspase⁃8 and Caspase⁃3 mRNA in ovarian tissues of rats

表2 3组大鼠卵巢组织中Fas，Fasl，Caspase⁃8，Caspase⁃3蛋白表达量比较Tab.2 Expression of Fas,Fasl,Caspase⁃8 and Caspase⁃3 proteins in ovarian tissues of rats ±s

表2 3组大鼠卵巢组织中Fas，Fasl，Caspase⁃8，Caspase⁃3蛋白表达量比较Tab.2 Expression of Fas,Fasl,Caspase⁃8 and Caspase⁃3 proteins in ovarian tissues of rats ±s

注：与阳性组比较，*P＜0.05，**P＜0.01；与中药组比较，#P＜0.05，##P＜0.01

n组别阳性组空白组中药组10 10 10 Fas/β⁃actin 0.520±0.102#0.308±0.081**0.395±0.024*Fasl/β⁃actin 0.643±0.060#0.460±0.043**0.540±0.082*Caspase⁃8/β⁃actin 0.495±0.010#0.293±0.030**0.390±0.032*Caspase3/β⁃actin 0.758±0.146 0.415±0.099**0.580±0.170

图2 3组大鼠卵巢组织中Fas，Fasl，Caspase⁃8，Caspase⁃3蛋白表达量比较Fig.2 Expression of Fas,Fasl,Caspase⁃8 and Caspase⁃3 proteins in ovarian tissues of rats

3 讨论

《素问·上古天真论》云：“二七而天癸至，任脉通，太冲脉盛，月事以时下，故有子也”。肾中精气充盛，精血充盈，月经来潮，具备生育的基本条件。经后期的病理特点主要表现为血、阴、精的不足，血海空虚。经后增殖方具有补益气血，补肾滋阴之功效，全方以四君子汤加四物汤组成补益气血的主药；加鹿角霜、山萸肉以补肾滋阴；但阳生方能阴长，故宜选加甘温补养之品，以阳中求阴，选用杜仲、菟丝子、川椒补肾助阳。全方使气血旺盛，冲任得滋，胎孕易成。IVF⁃ET过程中控制性超排卵降低了卵母细胞发育潜能，影响胚胎种植率，导致临床妊娠率低。本课题组前期研究已表明，中药经后增殖方可提高IVF⁃ET患者的胚胎种植率和临床妊娠率，并对经后增殖方与控制性超排卵大鼠卵巢颗粒细胞凋亡的关系进行了初步探讨［4-5］。因此，为了对经后增殖方的作用机制进行进一步研究，本研究选取了Fas细胞凋亡通路进行研究。

卵泡是卵巢的基本结构和功能单位，卵泡的成熟与闭锁取决于卵泡内颗粒细胞的状态：颗粒细胞增殖分化则卵泡成熟，颗粒细胞凋亡则卵泡闭锁。颗粒细胞伴随着卵母细胞发育、成熟、排卵至受精的全过程，对卵母细胞的发育至关重要［7］。细胞凋亡的发生和抑制与不同的基因有关，以Fas系统为代表的死亡受体信号转导途径是其中的重要凋亡途径之一［8-9］。Fas系统属于肿瘤坏死因子受体家族，Fas是一种细胞膜糖蛋白，FasL是其同源的Ⅱ型膜蛋白，是其体内唯一的天然配体。Fas存在于靶细胞上，FasL通过三聚体的形式与之相结合，导致Fas相关死亡结构域（FADD）被激活。相应的，FADD构成procaspase⁃8自我活化一个对接点，Caspase⁃8是caspase家族的启动者，caspase家族一旦激活，Caspase⁃8可激活其他下游caspase蛋白酶。其中，Caspase⁃3是Fas介导细胞凋亡信号传导通路中的“核心”蛋白酶，是细胞凋亡性死亡的最终执行者［10］。因此，Fas⁃Fasl⁃FADD⁃Caspase⁃8⁃Caspase⁃3 通路的激活最终导致细胞凋亡不可逆的发生。

本实验运用了qPCR和Western Blot技术检测Fas，Fasl，Caspase⁃8，Caspase⁃3 mRNA 和蛋白在大鼠卵巢组织中的表达。结果显示，阳性组即控制性超排卵组，在Fas，Fasl，Caspase⁃8，Caspase⁃3基因及蛋白的表达上均呈现出较高表达，且显著高于空白组，说明COH过程可导致卵巢颗粒细胞凋亡的发生，从而影响卵母细胞质量，这与PARKER和BARROS等的研究结果一致［11-12］，表明COH可能会损害卵母细胞的基因表达进而影响胚胎质量。李婷婷等［13］研究表明，中药二至天癸颗粒可下调肾气虚不孕患者卵泡液颗粒细胞Fas基因表达水平，推测二至天癸颗粒可能是通过下调Fas通路的表达来抑制颗粒细胞凋亡。蒋帅［14］研究证实中药六味地黄免煎颗粒能明显抑制肾阴虚型IVF⁃ET患者Fas介导的颗粒细胞凋亡信号通路，改善卵巢“封藏”功能，提高卵细胞质量，从而提高IVF⁃ET的临床妊娠率。但以上研究局限于对临床肾气虚及肾阴虚不孕症患者的观察，有待进一步深入。本实验中COH大鼠经过中药经后增殖方干预后，卵巢组织中凋亡因子 Fas，Fasl，Caspase⁃8，Caspase⁃3基因及蛋白表达均下降，且中药组与空白组之间差异无统计学意义，说明中药经后增殖方可下调Fas通路关键凋亡因子的表达水平，抑制超排卵大鼠卵巢颗粒细胞凋亡的发生，并且可使其接近于自然排卵大鼠状态，从而提高卵母细胞质量，改善卵泡质量和胚胎发育潜能。本实验对前期研究进行了进一步的补充，为临床运用中药经后增殖方改善卵母细胞质量提供科学的实验依据。

综上所述，中药经后增殖方能下调超排卵大鼠卵巢颗粒细胞Fas凋亡通路上关键因子基因及其蛋白的表达，抑制颗粒细胞凋亡，因此，推测Fas通路可能是经后增殖方改善卵母细胞质量的作用靶点之一。

参考文献

［1］韩霞.补肾安胎中药对着床障碍小鼠炎性因子含量的影响［J］.新中医，2013，45（2）：134⁃136.

［2］张晓思，钟秀会.黄芩白术对着床期小鼠IFN⁃γ、IL⁃10及NO含量的影响［J］.动物医学进展，2010，31（6）：80⁃84.

［3］LI H X，GUO X Y，XIE Y，et al.Yiqixue buganshen recipe regulates the expression of integrinα ν β 3 in the endometrium of controlled ovarian hyperstimulation mice［J］.Chin J Integr Med，2013，19（10）：755⁃760.

［4］邓伟民，邵玉，张金玉，等.中药益气血补肝肾法对辅助生育胚胎种植率的影响［J］.广州中医药大学学报，2008，（2）：106⁃109.

［5］杨贞，郭新宇，邓伟民，等.益气血法对超排卵大鼠卵巢颗粒细胞凋亡及Bim表达的影响［J］.实用医学杂志，2017，33（10）：1593⁃1596.

［7］吴小华，程立立，张敏，等.卵母细胞分泌因子在人卵丘颗粒细胞中的表达及其与卵母细胞发育潜能的关系［J］.生殖与避孕，2016（9）：701⁃707.

［8］LEE P，SATA M，LEFER D J，et al.Fas pathway is a critical mediator of cardiac myocyte death and MI during ischemia⁃re⁃perfusion in vivo［J］.Am J Physiol Heart Circ Physiol，2003，284（2）：H456⁃H463.

［9］LI H Z，HAN L P，JIANG C M，et al.Efect of dopamine re⁃ceptor⁃1 on apoptosis of cultured neonatal rat eardiomyocytes in simulated ischemia reperfusion［J］.Basic Clin Pharmaeol Toxi⁃col，2008，102（3）：329⁃336.

［10］HAMMAM O，MAHMOUD O，ZAHRA M，et al.The role of fas/fasl ligand system in the pathogenesis of liver cirrhosis and he⁃patocellularcar cinoma［J］.Hepat Mon，2012，12：e6132.

［11］PARKER GADDIS K L，DIKMEN S，NULL D J，et al.Evalua⁃tion of genetic components in traits related to superovulation，in vitro fertilization，and embryo transfer in Holstein cattle［J］.J Dairy Sci，2017，100（4）：2877-2891.

［12］BARROS C M，SATRAPA R A，CASTILHO A C，et al.Effect of superstimulatory treatments on the expression of genes relat⁃ed to ovulatory capacity，oocyte competence and embryo devel⁃opment in cattle［J］.Reprod Fertil Dev，2012，25（1）：17-25.

［13］李婷婷，连方，孙振高，等.二至天癸颗粒对肾气虚不孕患者颗粒细胞Fas通路的影响［J］.辽宁中医杂志，2017，44（3）：540-542.

［14］蒋帅.基于Fas凋亡通路探讨六味地黄免煎颗粒对肾阴虚IVF-ET妊娠结局的作用机理［D］.济南：山东中医药大学，2015.