CaMKII 介导20⁃HETE 诱导的乳鼠心肌细胞凋亡作用机制研究

贺滟 贾蝉忆 韩楚依 侯宏保 陈远寿 韩勇

1遵义医学院生理教研室（贵州遵义 563000）；2山西医科大学药剂学教研室（太原 030001）

20⁃羟二十烷四烯酸（20⁃hydroxyeicosatetraeno⁃ic acid，20⁃HETE）是由细胞色素P⁃450（CYP）酶催化花生四烯酸（arachidonic acid，AA）生成的重要血管活性物质［1］。最近研究发现20⁃HETE通过诱导心肌细胞凋亡作用，参与心肌缺血再灌注损伤（ischemia⁃reperfusion injury，IRI）进程中，加重再灌注后心肌梗死面积的发生［2］，但其中机制尚待进一步研究。Ca2+作为重要的第二信使对于维持心肌细胞正常功能起到至关重要的作用，Ca2+平衡紊乱引发的钙超载是诱导细胞凋亡的重要因素［3-4］。在心肌细胞中，钙离子/钙调蛋白依赖性蛋白激酶（CaMKII）是调节Ca2+稳态平衡的重要激酶，其激活后通过影响肌浆网Ryanodine（RyR2）受体通道、肌浆网钙泵（SERCA2a）功能等作用引起细胞内Ca2+平衡紊乱，从而参与多种因素诱导的心肌细胞凋亡进程中［5-6］。然而，目前尚无20⁃HETE对心肌细胞内钙离子浓度（［Ca2+］i）影响及相关作用机制的研究报道。因此，本研究主要观察20⁃HETE对于培养的乳鼠心肌细胞凋亡及细胞内钙离子浓度的影响，并探究这其中CaMKII信号通路发挥的作用，为临床治疗相关缺血性心肌病提供新的思路。

1 材料与方法

1.1 主要试剂与仪器 20⁃HETE、KN⁃93及Fluo⁃3/AM钙离子荧光探针（Sigma公司，美国），II型胶原酶（Sigma公司，美国），DMEM/F12培养基（HyClone公司，美国），CCK⁃8细胞活性检测试剂盒（同仁公司，日本），TUNEL细胞凋亡检测试剂盒（南京凯基生物公司，中国），BCA蛋白定量试剂盒（上海碧云天公司，中国），小鼠抗SERCA2a（货号ab205719）、小鼠抗RyR2（货号ab205719）、兔抗CaMKIIδ（货号ab205718）及兔抗磷酸化 CaMKIIδ（p⁃CaMKIIδ，货号ab182647）（Abcam公司，美国），β⁃actin及HRP标记二抗（Proteintech公司，美国），激光共聚焦显微镜（Leica公司，德国），CO2细胞培养箱（Thermo公司，美国）。

1.2 乳鼠心肌细胞原代培养 实验采用1～3 d龄SD大鼠，购自第三军医大学实验动物中心。乳鼠开胸取出心脏，在冷PBS中将心脏剪成1 mm3碎块，心肌组织使用0.125%胰蛋白酶和0.01%的Ⅱ型胶原酶，37℃水浴消化10 min，反复消化6～8次至组织完全消化。将多次消化获得细胞悬液1 000g离心10 min，弃上清，加入含15%胎牛血清的DMEM/F12培养基重悬细胞，37℃下5%CO2细胞培养箱内差速贴壁培养90 min，将分离纯化的心肌细胞接种于细胞培养板中。培养液中加入15%胎牛血清，青、链霉素（100 U/mL，0.1 mg/mL）及终浓度100 μmol/L的5⁃溴脱氧尿嘧啶核苷（抑制成纤维细胞生长），于5%CO2细胞培养箱37℃下培养48 h后，更换无血清培养基继续培养12 h，用于后续实验。

1.3 实验分组 细胞无血清培养12 h后，随机分为4组，A组：对照组，培养液不做任何药物处理继续培养24 h；B组：20⁃HETE组，培养液中加入100 nmol/L的 20⁃HETE 后继续培养 24 h；C 组：20⁃HETE+KN⁃93组，培养液中加入KN⁃93（3 μmol/L）孵育30 min后加入100 nmol/L 20⁃HETE培养24 h；D组：KN⁃93组（3 μmol/L），培养液中加入KN⁃93后培养24 h。

1.4 CCK⁃8法检测细胞活性 乳鼠心肌细胞于96孔板中更换无血清培养液培养12 h后，分别加入1、3、10、50和100 nmol/L不同浓度20⁃HETE，继续培养24 h，在不同时段（0、6、12、18、24 h）检测细胞活性，分别加入10 μL CCK⁃8溶液孵育2 h，酶标仪450 nm波长检测吸光度，每组设置6个复孔，重复3次，取平均值。

1.5 TUNEL法检测细胞凋亡 乳鼠心肌细胞使用不同药物处理后，室温下使用4%多聚甲醛溶液固定20 min，PBS溶液冲洗3次，0.1%Triton X⁃100溶液处理10 min，PBS冲洗后加入50 μL TUNEL反应混合液，37℃下孵育60 mim，荧光显微镜下检测结果。TUNEL阳性细胞为绿色荧光，计算每100个细胞中核阳性荧光占百分比。

1.6 Fluo⁃3/AM荧光探针检测心肌细胞［Ca2+］i乳鼠心肌细胞培养于盖玻片上并经不同药物处理后，放入含5%的Pluronic F⁃127及Fluo⁃3/AM（5 μmol/L）的DMEM/F12溶液中避光负载40 min，负载后使用新鲜DMEM/F12溶液清洗多余染料。激光共聚焦显微镜下扫描细胞荧光强度，激发波长488 nm，发射波长530 nm，以平均荧光强度反映细胞内［Ca2+］i，ImageJ软件分析。

1.7 Western Blot检测蛋白表达 乳鼠心肌细胞于使用不同药物处理后，加入细胞裂解液，离心后取上清液BCA法检测蛋白浓度。取等量蛋白（上样量60 μg）进行聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS⁃PAGE），转膜后封闭1 h，分别加入一抗（小鼠抗SERCA2a、小鼠抗 RyR2、兔抗 CaMKIIδ以及兔抗p⁃CaMKIIδ）4℃摇床孵育过夜。一抗孵育后加入辣根过氧化物标记的二抗（抗小鼠或抗兔）室温孵育1 h。ECL法显影，暗室曝光，软件分析蛋白条带光度值，β⁃actin作为内参，以靶蛋白/β⁃actin的比值反应蛋白表达水平。

1.8 统计学方法 采用SPSS 17.0软件统计分析，数据以±s表示，组间比较采用单因素方差分析及LSD⁃t方法检验统计，P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 20⁃HETE对心肌细胞活性的影响 结果如图1所示，1～3 nmol/L的20⁃HETE处理6～24 h对心肌细胞活性无显著影响。与对照组和溶媒组相比，10、50及100 nmol/L的20⁃HETE处理18～ 24 h后，明显引起心肌细胞损伤，其中100 nmol/L的20⁃HETE处理24 h后，细胞活性显著下降至（58.3±4.22）%。结果表明20⁃HETE可以时间及浓度依赖性造成心肌细胞损伤。

2.2 KN⁃93对20⁃HETE诱导的细胞凋亡影响 前期研究发现20⁃HETE具有诱导心肌细胞凋亡作用，本研究检测了CaMKII特异性抑制剂KN⁃93对20⁃HETE引起细胞凋亡的影响。结果如图2所示，20⁃HETE处理后心肌细胞TUNEL染色阳性细胞明显升高，由对照组的（2.31±1.32）%升至（49.8±2.3）%（P＜ 0.05），而加入KN⁃93后，细胞凋亡率恢复至（23.1±4.2）%（P＜0.05），表明CaMKII信号通路参与了20⁃HETE诱导的细胞凋亡作用。

2.3 20⁃HETE对［Ca2+］i影响及KN⁃93的作用 心肌细胞内Ca2+的稳定对于维持细胞正常功能具有重要作用，［Ca2+］i升高引起的钙超载是诱导心肌细胞凋亡的关键因素。因此，本研究应用Fluo⁃3/AM荧光探针法检测了20⁃HETE对［Ca2+］i的影响及KN⁃93的作用。结果如图3所示，与对照组相比，20⁃HETE组心肌细胞［Ca2+］i显著增加了75%（P＜0.05），而加入CaMKII特异性阻断剂KN⁃93后，显著阻断了20⁃HETE诱导的［Ca2+］i升高（P＜0.05）。表明20⁃HETE具有显著升高［Ca2+］i的作用，诱发细胞钙超载，而CaMKII信号通路介导了该效应。

2.4 20⁃HETE对RyR2、SERCA2a蛋白表达影响及KN⁃93的作用 兰尼碱受体通道2（Ryanodine receptor 2，RyR2）和肌浆网钙泵ATP酶（sarcoplas⁃mic reticulum Ca2+⁃ATPase2a，SERCA2a）是心肌细胞肌浆网膜上主要调节细胞内钙释放和回摄的重要蛋白，同时也是受CaMKII调节的下游靶点。因此，为探究20⁃HETE诱导［Ca2+］i升高的机制，我们检测了20⁃HETE对RyR2和SERCA2a的蛋白水平表达的影响以及KN⁃93的作用。结果发现，20⁃HETE处理后的心肌细胞中，RyR2的蛋白表达量是对照组的3.3倍，而SERCA2a的蛋白表达比对照组下降32%（P＜0.05）；加入CaMKII特异性阻断剂KN⁃93共同处理后，显著抑制了20⁃HETE上述效应。如上结果表明，20⁃HETE通过影响肌浆网钙通道蛋白表达改变导致细胞内Ca2+平衡紊乱，同时CaMKII信号通路参与了20⁃HETE这种作用。

图1 不同浓度和处理时间条件下20⁃HETE对心肌细胞活性的影响Fig.1 Effects of 20⁃HETE on cardiomyocyte activity at different concentrations and treating duration

图2 KN⁃93对20⁃HETE诱导的心肌细胞凋亡影响Fig.2 Effects of KN⁃93 on 20⁃HETE⁃induced cardiomyocyte apoptosis

2.5 20⁃HETE 对CaMKIIδ表达及磷酸化的影响 CaMKIIδ亚型特异性表达于心肌组织，在心肌细胞的Ca2+调控中起动态调节作用，CaMKIIδ表达升高、活性增强被认为与细胞凋亡、肥大甚至心衰密切相关。因此，本研究通过Western Blot分析了20⁃HETE对CaMKIIδ蛋白和磷酸化水平的影响。结果如图5所示，与对照组相比，20⁃HETE显著增加了CaMKIIδ的表达并促进其磷酸化水平升高（P＜ 0.05），KN⁃93阻断了这种效应。说明20⁃HETE可通过激活CaMKII信号通路机制诱导心肌细胞［Ca2+］i升高及凋亡。

3 讨论

20⁃HETE是由CYP酶家族中CYP4A和4F酶催化AA生成的重要血管活性物质，大量研究表明20⁃HETE在调节肾、脑、骨骼肌和肠系膜等动脉血管平滑肌肌源性收缩中发挥了重要的作用，它的合成与释放与多种血管性疾病密切相关，如高血压、血管内皮功能紊乱、炎性反应以及血管再生等［1，7］。近年研究发现CYP4A和4F酶在心肌组织中表达，在IRI进程中，CYP4A和4F表达上调、20⁃HETE含量增加，WEI等［8］在体大鼠IRI研究发现，抑制20⁃HETE合成对改善大鼠再灌注后心肌具有显著的保护作用，可有效减少心肌梗死面积的发生。然而，20⁃HETE参与IRI的具体作用机制尚待研究。临床及实验研究表明，心肌细胞凋亡与IRI的发生、发展密切相关，是再灌注损伤发病机制中重要环节［9］。我们前期研究发现，20⁃HETE可通过线粒体依赖的内源性途径诱导培养的乳鼠心肌细胞凋亡［10］。此外，在离体大鼠心肌缺血再灌注模型中研究发现，20⁃HETE可通过增加细胞内活性氧簇生成诱导细胞凋亡，加重再灌注后心肌损伤［2］。而在本研究中发现，CaMKII信号通路参与20⁃HETE诱导的心肌细胞凋亡进程中。结果发现，20⁃HETE呈浓度依赖性导致心肌细胞损伤，具有显著的促进细胞凋亡作用；而应用CaMKII特异性抑制剂——KN⁃93，阻断了20⁃HETE这种作用，提示CaMKII信号通路参与了20⁃HETE诱导的细胞凋亡，但其中具体机制尚需进一步探究。

图3 20⁃HETE对［Ca2+］i影响及KN⁃93的作用Fig.3 Effects of 20⁃HETE on［Ca2+］i and the role of KN⁃93

图4 20⁃HETE对RyR2、SERCA2a蛋白表达影响及KN⁃93的作用Fig.4 Effects of 20⁃HETE on the expression of RyR2 and SERCA2a and the role of KN⁃93

Ca2+在心肌细胞的功能与代谢活动中发挥了关键性的调节作用，它不仅是兴奋⁃收缩耦联的重要因子，而且作为第二信使参与细胞凋亡的调控［3-4］，目前已知的细胞凋亡三条途径中（线粒体途径、内质网途径、死亡受体途径）均与细胞内［Ca2+］i升高引起的Ca2+超载密切相关。因此，为探究20⁃HETE诱导心肌细胞凋亡机制，本研究首先观察了20⁃HETE对心肌细胞的［Ca2+］i影响。结果发现20⁃HETE可显著升高心肌细胞［Ca2+］i，具有诱发钙超载作用。在心肌细胞中，收缩期胞浆中Ca2+主要来源于肌浆网钙库，RyR2受体通道是释放钙库Ca2+的主要途径［11］。在舒张期，胞浆内92%Ca2+的清除通过SERCA2a的摄取作用转运回肌浆网［3］，心肌细胞内钙稳态的调控与RyR2和SER⁃CA2a的功能密切相关。因此，本研究观察了20⁃HETE对肌浆网RyR2和SERCA2a表达的影响，探究20⁃HETE诱导心肌细胞钙超载机制。结果发现，20⁃HETE一方面可以促进RyR2表达升高，其结果引起肌浆网钙库释放Ca2+能力增强；另一方面20⁃HETE降低了SERCA2a表达，导致舒张期肌浆网对Ca2+回摄能力下降，通过这两方面机制导致［Ca2+］i升高，诱发钙超载。同时发现，应用KN⁃93抑制CaMKII作用显著阻断了20⁃HETE诱发的钙超载的效应。

CaMKII是机体内重要的蛋白激酶，包括四种亚型，CaMKIIα和CaMKIIβ主要表达于神经组织，CaMKIIγ和CaMKIIδ在多种组织中存在，在心脏中主要表达 CaMKIIδ［6］。近年研究表明，CaMKII在心肌肥大、细胞凋亡甚至心衰发病进程发挥关键作用［12-14］。在心肌细胞凋亡进程中，CaMKII的蛋白表达增高、磷酸化水平增强［13］，而活化的CaM⁃KII可通过多种途径调节细胞内Ca2+平衡，其中肌浆网Ca2+转运蛋白RyR2和SERCA2a是其重要的下游调节靶点［3］。CaMKII激活后，一方面通过磷酸化RyR2，增加后者对Ca2+的敏感性，增加肌浆网钙库Ca2+释放；另一方面通过对受磷蛋白（phos⁃pholamban，PLB）磷酸化，解除其对SERCA2a抑制作用，增强肌浆网对 Ca2+的回摄［5，15］。在本研究中发现，20⁃HETE显著上调CaMKIIδ蛋白表达，同时提高其Thr287位点磷酸化水平，表明20⁃HETE具有明显激活CaMKII的作用，20-HETE通过对CaMKII的激活继而影响RyR2和SERCA2a功能的改变，从而导致心肌细胞内钙离子平衡的调节紊乱，诱发钙超载。虽然CaMKII激活后，其直接作用是磷酸化PLB、增强SERCA2a功能，促进Ca2+回摄至肌浆网内，但有研究表明，SERCA2a回摄Ca2+功能还依赖于SERCA2a表达与磷酸化PLB的比率［16］。本研究中发现20⁃HETE可降低SERCA2a总蛋白的表达，因此通过减小SERCA2a与PLB的比率，从而降低了SERCA2a回摄Ca2+能力。如上结果表明，20⁃HETE一方面通过直接影响RyR2和SERCA2a的蛋白表达；另一方面通过激活CaMKII间接影响RyR2和SERCA2a功能，最终导致心肌细胞内Ca2+平衡的紊乱。

近年研究发现体内多种活性物质，如异丙肾上腺素、血管紧张素Ⅱ、肾上腺素、内皮素等具有激活CaMKII作用，从而参与相关心血管疾病的发生、发展［6，12，17-18］，而本研究中发现，20⁃HETE 可上调CaMKII蛋白表达、磷酸化水平增强，表明20⁃HETE具有显著激活CaMKII效应，并通过CaMKII介导了其导致的细胞内钙超载和细胞凋亡作用。虽然20⁃HETE激活CaMKII的具体机制尚待探明，但我们前期研究发现，20⁃HETE具有激活心肌细胞L⁃型钙离子通道、增加细胞内Ca2+浓度以及诱发细胞内 ROS 生成等生物作用［2，19］，细胞内 Ca2+浓度升高是激活CaMKII的必要条件，而细胞内ROS水平增高则可对CaMKII调节结构域氧化修饰，阻止与催化结构域的重新结合从而保持激酶活性［6］。因此，20⁃HETE 对心肌细胞内 Ca2+浓度及ROS生成的影响是其激活CaMKII的重要的潜在机制。

综上所述，以往的研究发现20⁃HETE通过诱导心肌细胞凋亡参与IRI进程中，本研究在培养的乳鼠心肌细胞中发现，20⁃HETE通过激活CaM⁃KII，引起肌浆网Ca2+转运蛋白RyR2和SERCA2a功能改变，导致心肌细胞钙超载，诱导心肌细胞凋亡，这可能是20⁃HETE加重IRI损伤的重要机制之一。如上发现为临床治疗相关的缺血性心肌病以及心衰的药物治疗靶点提供理论依据与新思路。

图5 20⁃HETE对CaMKIIδ表达及磷酸化的影响Fig.5 Effects of 20⁃HETE on CaMKIIδ protein expression and phosphorylation

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