超声波辅助提取魁蒿总黄酮响应面法优化工艺*

张 杉,肖 娟,宋晓慧,熊利芝

(吉首大学生物资源与环境科学学院，湖南 吉首 416000)

自然界中植物含有许多对人类身心有益的活性物质，魁蒿中的黄酮就是其中颇具功效的一种.魁蒿(ArtemisiaprincepsPamp.)，菊科，蒿属，多年生全国广布性草本植物.味辛苦，民间常用药，有止血、消炎等功效，对妇科疾病也有很好的功效[1].适当摄入黄酮能够降低癌症、骨质疏松症[2-3]等疾病的发病率.目前提取黄酮的方法[4-6]有很多，各有优劣.近年来，在植物内含物提取方面，超声波提取技术的应用越来越广泛.效率高、不易破坏有效成分[7]是超声波提取技术的显著特点，因此运用超声波技术提取植物内含物可以增大活性物质进入溶剂的速度，既缩短提取时间，又增加提取率.目前，通过超声波技术提取魁蒿总黄酮还未见报道，本次实验主要以超声波技术提取魁蒿总黄酮，以响应面的方法探讨并优化提取工艺.

1 材料与仪器

1.1 材料与试剂

魁蒿：取样于吉首大学周边地区.选取叶片完整的魁蒿，蒸馏水洗净后晾干，50 ℃烘干，粉粹过40目筛，保存备用.试剂：芦丁(上海阿拉丁工业有限公司，纯度大于98.0%)；无水乙醇(成都金山化学试剂有限公司，纯度大于99.7%)；NaNO2(成都金山化学试剂有限公司，纯度大于99.0%)；Al(NO3)3(成都金山化学试剂有限公司，纯度大于99.0%)；NaOH(天津石英钟厂霸州市化工厂，纯度大于96.0%).

1.2 仪器

仪器：T6新世纪型紫外可见分光光度计(北京普析通用仪器有限责任公司)；KQ-250DE型数控超声波清洗器(昆山市超声仪器有限公司)；TDZ4型台式低速离心机(湖南赫西仪器装备有限公司).

2 实验方法

2.1 标准曲线制作

采用5% NaNO2-10% Al(NO3)3-4% NaOH法[8]制作，得标准曲线方程Y=10.335X-0.003 8，R2=0.999 4.其中：Y为吸光度；X为黄酮质量浓度，单位g·L-1.

2.2 总黄酮的提取

取不同体积分数的乙醇提取剂置于装有适量样品的锥形瓶中，于超声清洗器中提取，离心后取上层清液定容，即得提取液.

2.3 总黄酮的测定

将提取液稀释数倍，按照标准曲线制作的方法测定，得其吸光度，根据标准曲线方程计算提取液浓度.参照文献[9]计算魁蒿总黄酮提取率.

2.4 单因素实验

按次序研究料液比等5个因素对魁蒿总黄酮提取率的影响，实验内容见表1.

表1 单因素Table 1 Single Factors

2.5 响应面优化实验

从单因素实验中选取影响较大的因素进行响应面实验[10]，按DE软件分析得出最适工艺条件.

2.6 重复验证实验

用DE实验设计软件分析实验结果得出最佳工艺，并进行3次平行实验.

3 结果与讨论

3.1 单因素实验

图1 乙醇体积分数对总黄酮提取率的影响Fig.1 Effect of Ethanol Volume Fraction on Extraction Rate of Flavonoids

3.1.1 乙醇体积分数对总黄酮提取的影响 分别准确称取1 g魁蒿粗粉置于5个锥形瓶，在温度为55 ℃、功率为200 W、时间为30 min和料液比为1∶20(g∶mL)的条件下，按表1中因素Ⅰ次序依次加入不同体积分数溶剂提取.结果如图1所示.由图1可知，在乙醇体积分数大于40%且小于70%时，乙醇体积分数越高，总黄酮提取率越大；但当乙醇体积分数大于70%时，总黄酮提取率降低.这可能是魁蒿总黄酮极性[11]与乙醇体积分数70%的溶液极性接近的原因，因而选体积分数70%的乙醇溶液为魁蒿提取的总黄酮的提取液.

图2 料液比对总黄酮提取率的影响Fig.2 Effect of Material-to-Liquid Ratio on Extraction Rate of Flavonoids

3.1.2 料液比对总黄酮提取率的影响 分别准确称取1 g魁蒿粗粉置于5个锥形瓶，在温度55 ℃、功率200 W、时间30 min和乙醇体积分数70%的条件下，按表1中因素Ⅱ次序依次以不同料液比提取.实验结果如图2所示.由图2可知，总黄酮提取率在料液比为1∶20(g∶mL)时提取率最高，在料液比小于1∶20(g∶mL)时呈上升趋势，此后呈下降趋势.这可能与促进黄酮析出的质子推动力有关[11]，在料液比为1∶15至1∶20(g∶mL)之间质子推动力较大，因此提取率升高.在料液比低于1∶20(g∶mL)时，总黄酮提取率降低，这可能与提取液中渗透压有关[12]，由于细胞外料液比下降致使渗透压降低，从而导致总黄酮析出率下降.

图3 超声功率对总黄酮提取的影响Fig.3 Effect of Ultrasonic Power on Extraction Rate of Flavonoids

3.1.3 提取功率对总黄酮提取率的影响 分别准确称取1 g魁蒿粗粉置于5个锥形瓶，在温度55 ℃、时间30 min、乙醇体积分数70%和料液比为1∶20(g∶mL)的条件下，分别按表1的因素Ⅲ不同水平下依次提取.实验结果如图3所示.从图3可知，总黄酮提取率随超声功率的变化趋势呈单峰状，于200 W达极大值，左侧呈上升趋势，右侧呈下降趋势.一定功率的超声波能够增加魁蒿细胞的破碎程度[13]，增加总黄酮析出率.但总黄酮析出的同时其他物质的析出也增加，因而使细胞内外渗透压改变，当超声功率超过一定值时反而使总黄酮析出率降低.

图4 提取温度对总黄酮提取率的影响Fig.4 Effect of Temperature on Extraction Rate of Flavonoids

3.1.4 提取温度对总黄酮提取率的影响 分别准确称取1 g魁蒿粗粉置于5个锥形瓶，在乙醇体积分数为70%、料液比为1∶20(g∶mL)、时间30 min和超声功率200 W的条件下，按表1因素Ⅳ的次序提取.实验结果如图4所示.由图4可知，在35～65 ℃之间，温度升高，总黄酮提取率增大，但温度高于65 ℃时反而减小.温度影响细胞的渗透压和溶质的扩散，在低于最适温时，温度的升高能够提高细胞的渗透压，加速溶质的扩散[13].本试验中，在35～65 ℃之间，温度的升高加速总黄酮的渗透，增加溶解速度，提高析出率.但温度超过最适温度65 ℃时，黄酮中某些物质易被氧化[13]，因而降低了提取率.

图5 时间对总黄酮提取率的影响Fig.5 Effects of Time on Extraction Rate of Flavonoids

3.1.5 提取时间对总黄酮提取率的影响 分别准确称取1 g魁蒿粗粉置于5个锥形瓶，在乙醇体积分数为70%、料液比为1∶20(g∶mL)、超声功率200 W和温度65 ℃的条件下，分别对魁蒿粉末按表1因素Ⅴ的水平次序提取，测定吸光值并计算提取率.实验结果如图5所示.图5表明，魁蒿总黄酮提取率随提取时间的延长先升高而后降低；提取40 min时总黄酮提取率达到极大值；提取时间超过40 min后总黄酮提取率随着提取时间的延长而下降.物质提取过程中，有用物质析出的同时会释放相关分解酶[13].本实验中，提取时间超过40 min时，可能某些能够降解黄酮物质的酶增加，降解了黄酮，总黄酮提取率下降.

3.2 响应面分析

3.2.1 响应面实验设计表 响应面四因素三水平实验设计如表2所示.

表2 响应面四因素三水平实验设计Table 2 Design of 4-Factors and 3-Level Experiment by in Response Surface Methodology

3.2.2 响应面实验数据结果 以上述各单因素中影响较大的因素作为实验自变量，魁蒿总黄酮提取率作为实验因变量，进行响应面优化实验.实验结果列于表3.

表3 响应面实验结果Table 3 Experimental Results by Response Surface Methodology

3.2.3 响应面实验数据方差分析 用DE设计软件分析表3实验结果的方差，结果见表4.

表4 方差分析Table 4 Variance Analysis

注：①表示p<0.001极显著;②表示0.001

方差分析中，失拟项显著性反应模型选择是否良好：失拟项显著表示不能用此模型进行预测，模型选择有误，反之则模型选择良好.[10]

表4中，p模型<0.000 1，说明该模型拟合程度较好，能够很好地预测本次实验最佳理论数值.因素平方项A2、B2、C2、D2和单因素项A对总黄酮影响显示为极显著，说明其对实验目标影响极大；单因素项B、C、D和两因素相互作用项BD、CD显示显著，说明其对实验目标影响较大；AB及AC表现为无显著性，说明其对响应值影响效果不明显.从上述对因素影响效果的方差分析可知，魁蒿总黄酮提取率受所选因子影响次序从大到小依次为料液比、超声功率、提取温度和提取时间.

经过回归拟合得出拟合方程[14]:

黄酮提取率/%=2.494+0.041A-0.027B+0.027C-0.024D-0.012AB+0.002AC-0.026AD+0.032BC+0.044BD-0.051CD-0.320A2-0.140B2-0.250C2-0.270D2.

3.2.4 响应面对总黄酮提取影响的曲面分析 交互因素曲面分析如图6—11所示.

图6 料液比及温度对总黄酮提取率的响应曲面Fig.6 Response Surface Plot for Flavonoid Yield as a Function of Material-to-Liquid Ratio and Extraction Temperature

图7 料液比及时间对总黄酮提取率的响应曲面Fig.7 Response Surface Plot for Flavonoid Yield as a Function of Material-to-Liquid Ratio and Extraction Time

图8 料液比及功率对总黄酮提取率的响应曲面Fig.8 Response Surface Plot for Flavonoid Yield as a Function of Material-to-Liquid Ratio and Ultrasonic Power

图9 温度及时间对总黄酮提取率的响应曲面Fig.9 Response Surface Plot for Flavonoid Yield as a Function of Extraction Temperature and Time

图10 温度及功率对总黄酮提取率的响应曲面Fig.10 Response Surface Plot for Flavonoid Yield as a Function of Extraction Temperature and Ultrasonic Power

图11 时间及功率对总黄酮提取率的响应曲面Fig.11 Response Surface Plot for Flavonoid Yield as a Function of Extraction Time and Ultrasonic Power

响应面的曲面陡峭程度能反映出因素对考察值影响显著程度，曲面越陡峭代表影响越显著[15].图6—11响应曲面显示，四因素的交互影响[16]中，料液比与时间的共同作用对总黄酮提取率效果相对较小；时间与功率则相较强；其他因素的交互效果均具显著性差异.结合方差分析可以看出，曲面分析和方差分析没有显著差别.

实验得出理论最优条件：乙醇体积分数、料液比、提取时间、提取温度和超声功率分别为70%，1∶20.35(g∶mL)，51 min，65.06 ℃和201.5 W，提取率为2.499%.结合实验具体情况将条件稍作修改：乙醇体积分数70%、料液比1∶20(g∶mL)、提取时间50 min、提取温度65 ℃和超声功率200 W.平行重复实验结果为2.505%，2.486%和2.488%.总黄酮平均提取率为2.493%.

4 结论

经过超声波辅助提取以及对实验结果的方差分析，得出魁蒿总黄酮提取率受所选因子影响次序从大到小依次为：料液比、超声功率、提取温度、提取时间.响应面法分析得出最佳工艺条件为：料液比1∶20(g∶mL)、乙醇体积分数70%、提取时间50 min、提取温度65 ℃和超声功率200 W.在此工艺条件下，最大提取率达到2.493%.

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