一株对氯酚降解菌的筛选及降解特性

郑晓宁

（无棣县环境监测站，山东 无棣 251900）

氯取代酚属典型的难降解有机物，也是潜在的内分泌干扰物，其中的很多化合物被认为具有致癌、致畸、致突变和遗传毒性，美国环境保护局（USEPA）和我国都将氯取代酚列为优先控制有毒污染物[1]。但氯酚作为一类非常重要的工业有机化合物，被广泛应用于染料、防腐剂、除草剂、杀虫剂和杀菌剂等化合物的生产中，全球每年的氯酚生产量约为2×105t[2]。氯取代酚的大量生产与排放导致水质和土壤的严重污染[3]。由于该类化合物的芳香环结构以及氯取代基使得氯酚类化合物具有很强的抗降解能力，传统的物化和生化方法难以对该类化合物进行有效处理[4]。在实际废水中，氯取代酚经常与其他污染物质共同存在，其他有毒化合物的存在会抑制微生物的活性，增加氯取代酚的生物降解难度[5-6]。

1 材料与方法

1.1 试剂与培养基

基础盐培养基：（NH4）2SO41.0 g，K2HPO41.5 g，KH2PO40.5 g，NaCl 1.0 g，MgSO4·7H2O 0.2 g， 水1 L，pH 7.0～7.2。菌株降解试验时，所用基础盐培养基中添加终浓度为1%的葡萄糖。

LB培养基：酵母粉5 g，蛋白胨10 g，NaCl 5 g，水1 L，pH7.0～7.2。固体培养基在其中加入2%的琼脂粉。所有培养基使用前均在121℃下湿热灭菌20 min。

酵母粉、蛋白胨、琼脂等购自北京奥博星生物技术有限公司；液相色谱用甲醇为色谱纯，购自上海星可生化有限公司；对氯酚标样为色谱纯，购自安徽合肥融宇生物科技有限公司。其他试剂均为分析纯。

1.2 菌株的分离与纯化

将采自山东无棣的某制革废水用无菌水梯度稀释，涂布LB平板，挑取长出的菌落在LB液体培养基中扩大培养，将培养液转接到含有50 mg/L对氯酚的基础盐培养基中，于30℃、150 r/min的摇床上培养2 d，测定培养基中的对氯酚浓度，用紫外扫描仪通过波长扫描验证菌株降解对氯酚的效果。将有降解效果的菌株通过平板划线方法纯化后开展相关试验。

1.3 对氯酚的分析测定

菌株筛选过程中对氯酚降解能力的测定采用紫外扫描法：紫外扫描仪型号为UV-2300（上海天美科学仪器有限公司）；取1 mL培养液到1.5 mL离心管，于12000 r/min离心1 min，取上清液0.5 mL加基础盐培养基至终体积3 mL，于200～300 nm波长处连续扫描测定，特征吸收峰为281 nm。根据接菌与不接菌的样品间的差异，确定菌株的降解效果。

降解试验过程中对氯酚的测定采用液相色谱法：高效液相色谱仪为Waters Alliannce-2695型，配Waters SunFire C18 （4.6 nm×250 mm）色谱柱。流动相为甲醇:水（7:3，v:v），流速为0.7 mL/min，检测波长为200～300 nm，对氯酚的定量波长为281 nm，进样量20 μL，采用外标法按峰面积定量。其他化合物的定量波长统一采用260 nm，其他条件同对氯酚浓度的测定。

对氯酚降解率的计算公式为：

式中，Ct是接菌样品中的对氯酚终浓度；Cc是指对照（相同培养条件但未接入降解菌）样品中的对氯酚浓度；Y是指对氯酚的降解率。

对氯酚降解速率的计算公式为：

式中，Ct是接菌样品中的对氯酚终浓度；Cc是对氯酚初始浓度；t为Cc和Ct取样时间；Y为菌株降解对氯酚的平均速率。

1.4 菌株降解对氯酚试验

降解试验所用的菌悬液是指在LB培养基中培养至对数期后期（种子液OD600约为5.0）的培养液，所有实验均在250 mL锥形瓶中进行，若无特殊说明，对氯酚的初始浓度为100 mg/L，接种量为2%（v：v）。接种后，样品放于30℃、150 r/min的摇床上振荡培养，定时取样测定其中的对氯酚浓度。

2 结果与讨论

2.1 降解曲线试验

在100 mL的基础盐培养基中加入对氯酚，使对氯酚的终浓度为100 mg/L。在培养基中接入2 mL的菌悬液，放置于30℃、150 r/min摇床上振荡培养，定时取样。上述试验以不接任何菌株的样品为对照，结果如图1所示。试验结果表明，与未接入ZQ-1的对照组相比，加入ZQ-1可使培养液中的对氯酚浓度明显降低，48 h后几乎全部降解，说明菌株ZQ-1能够降解对氯酚；但在此过程中培养液的OD600没有明显变化，说明菌株不能以对氯酚进行生长。另外，接入ZQ-1，培养基的颜色变为褐色，随着培养时间的延长，褐色会加深。而对照和空白（接入ZQ-1但不加对氯酚）样品则没有这种颜色产生，这可能是菌株ZQ-1降解对氯酚的过程中产生了一种新物质，从而导致颜色变化。

图1 菌株ZQ-1降解对氯酚的曲线

2.2 环境条件对菌株降解对氯酚的影响

2.2.1 pH对菌株降解对氯酚的影响

pH值可以影响酶的活性、菌体对营养物质的吸收及菌体细胞的结构，从而影响菌体的生长和反应活性。用NaOH和HCl调节无机盐培养基的pH分别为4.0、5.0、6.0、7.0、8.0、9.0和10.0，灭菌后加入对氯酚，使对氯酚的终浓度为100 mg/L。接入菌株ZQ-1，置于30℃、150～170 r/min摇床振荡培养，在培养48 h时取样，测定对氯酚浓度。结果表明，菌株ZQ-1在pH＝6.0～8.0时能较好地降解对氯酚。

2.2.2 温度对菌株降解对氯酚的影响

将菌株ZQ-1接种于含对氯酚的无机盐培养基中，分别在20℃、25℃、30℃、35℃、40℃和45℃下恒温培养，对氯酚的初始浓度为100 mg/L，24 h后取样测定培养液中的对氯酚浓度。结果表明，35℃时该菌株降解对氯酚的效率最高，可统一达到70%。

2.3 对氯酚的初始浓度对菌株降解对氯酚的影响

在基础盐培养基中加入对氯酚，使对氯酚的终浓度分别为50 mg/L、100 mg/L、200 mg/L、300 mg/L和400 mg/L，按2%的接种量向其中接入降解菌株的菌悬液。12 h、24 h、36 h和48 h取样测定培养培养液中的对氯酚浓度。结果表明，对氯酚初始浓度为200 mg/L时，菌株降解对氯酚的速率最快。

2.4 菌株的降解谱试验

在基础盐培养基中分别添加苯酚、对氯酚、对甲酚、邻甲酚、1-萘酚、吡啶、间甲酚、2,4-二氯酚、3,5-二硝基酚、吩噻嗪、3,5-二硝基水杨酸和对硝基酚。接入菌株ZQ-1，结果表明，该菌对苯酚和对氯酚有较好的降解效果，对其他芳香族化合物无明显降解效果。

3 结论

从制革废水中分离到1株降解对氯酚的棒状菌属细菌ZQ-1。该菌株降解对氯酚的最适pH值为6.0～8.0，最适温度为35～40℃，对氯酚的初始浓度与菌株降解速率呈负相关，对对氯酚和苯酚具有较强的降解能力。

参考文献

1 YOUNES M.Specific issues in health risk assessment of endocrine disrupting chemicals and international activitie[J].Chemosphere，1999，39（8）：1253-1257.

2 姜 梅，牛世全，展惠英，等.氯酚类化合物的微生物降解研究进展[J].应用生态学报，2003，14（6）：1003-1006.

3 郜瑞莹，王建龙.pH对厌氧颗粒污泥吸附4-氯酚的影响[J].环境科学，2007，28（4）：791-794.

4 Peru-Titus M，Garcia-Molina V，Banos M A，etal.Degradation of chlorophenols by means of advanced oxidation processed[J].Applied Catalysis B Environmental，2004，47（4）：219-256.

5 全向春，施汉昌，王建龙，等.苯酚存在对生物强化系统降解2,4-二氯酚的影响[J].环境科学，2003，24（1）：75-79.

6 陈 皓，陈 玲，黄爱群，等.重金属对2-氯酚厌氧降解的抑制动力学研究[J].中国环境科学，2010，30（3）：328-332.