刺梨多糖的抗氧化和抗疲劳研究

曹晶晶，杨卫杰，曹 轶

(1. 河南医学高等专科学校，郑州 451191； 2. 河南科技大学医学院，河南 洛阳 471003)

过度运动易导致葡萄糖和糖原等能源耗尽，并会诱发血清乳酸(Lac)和血尿素 (BUN) 等代谢物过度积累从而引起疲劳[1]。另外人体在剧烈运动时也易产生过多的自由基，破坏细胞结构尤其是线粒体，并通过变性、交联、断裂或解聚等影响生物大小分子活性，加重运动性疲劳。近年来，寻找天然药用食用植物来缓减疲劳成为热点。研究显示，芦笋、黄秋葵和绣线菊都具有抗疲劳效果[2-4]。

刺梨又名文先果、送春归、缫丝花，是蔷薇科蔷薇属落叶灌木，原产云贵高原，四川、江西、湖北等省也有引种栽培，含有丰富的维生素C(Vc)、超氧化物歧化酶(SOD)、黄酮、多糖及多种人体必需的氨基酸。传统医学主要以根和果实入药，用于消食、止泻、解暑及积食腹胀、痢疾、肠炎、高血压、血管破裂出血、维生素C缺乏症等疾病的治疗。此外，刺梨还具有调节机体免疫功能、解毒、镇静、延缓衰老、抗动脉粥样硬化、抗肿瘤、清除体内自由基等功能[5-6]。本文利用刺梨多糖对小鼠抗疲劳进行研究，为刺梨的可持续利用提供科学依据。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 动物 KM小鼠体质量(16±2)g，购自中南大学湘雅医学院(合格证号湘检证字2008-0002)。在温度(23±3) ℃、相对湿度为50%的动物房中饲养，实验20 d期间每天秤量小鼠的体质量并记录。

1.1.2 药物和试剂 刺梨采集于贵州贵阳、青岩等地，经漯河医学高等专科学校赵喜兰副教授鉴定为RosaroxburghiiTratt.f.normalisRehd.etWils的果实；血糖试剂盒(北京博迈斯生物科技有限公司，批号20140412)；糖原检测试剂盒(北京博迈斯生物科技有限公司，批号20140908)；乳酸试剂盒(武汉艾美捷科技有限公司，批号141102)；乳酸脱氢酶试剂盒(LDH)、磷酸肌酸激酶(CK)、尿素氮(BUN)、超氧化歧物酶(SOD)、过氧化氢酶(CAT)、谷胱甘肽(GSH)和丙二醛 (MDA) 测定试剂盒(南京建成生物工程有限公司，批号150312、141209、150918、151204、150823、150728、150926)，其他均为分析纯。

1.1.3 仪器 TGL-16 M 高速台式冷冻离心机(湖南湘仪有限公司)；RE2000 旋转蒸发仪(上海亚荣生化仪器厂)；SHB-III循环水式多用真空泵(郑州长城科工有限公司)；UV power 紫外可见光分光光度计(北京莱伯泰科仪器股份有限公司)。

1.2 方法

1.2.1 刺梨多糖的制备 精密称量干燥刺梨10 kg，烘干粉碎后按照1∶5固液比加蒸馏水煎煮1 h，煎煮3次过滤合并提取液，减压浓缩后加入5倍体积的无水乙醇进行沉淀，过滤得粗多糖和上清液。上清液离心、减压浓缩得上清液多糖(Supernatant polysaccharide ofRosaroxburghiiTratt.f.normalisRehd.etWils，SRR)，而粗多糖蒸馏水溶解，加15%的三氯乙酸沉淀蛋白质过滤，浓缩上清液，冷冻干燥得刺梨多糖(Polysaccharide ofRosaroxburghiiTratt.f.normalisRehd.etWils,PRR)。SRR和PRR都保存在4 ℃冰箱中备用。

1.2.2 PRR和SRR中多糖含量的多糖含量的测定 (1)多糖标准曲线的绘制：精密秤定蒽酮0.1 g置于50 mL 量瓶中，乙酸乙酯定容、摇匀，即得0.20%蒽酮-乙酸乙酯显色剂。精密秤定无水葡糖糖100 mg，溶于50 ml的蒸馏水，配置成2 mg/ml 的葡萄糖溶液。准确吸取葡萄糖标准溶液0、1、2、3、4、5 ml，分别置于25 ml的据塞试管中，蒸馏水定容。精密量取1 ml，加4 ml 浓硫酸摇匀，5 min 后加1 mL 显色剂摇匀。置于100 ℃水浴加热10 min，取出速冷至室温后，以6 mL 对照品溶液为空白试剂，波长600 nm测定吸光度。以吸光值为纵坐标，浓度为横坐标绘制标准曲线，回归方程Y=3.956X-0.0078，r=0.9997(线性范围为0.040～0.20 mg/mL)。(2)PRR和SRR中多糖含量测定：取PRR和SRR各0.1 g加入100 ml容量瓶中，蒸馏水定容得供试液。精密量取供试液1 mL，同“2.1”项下显色，在波长600 nm测定吸光度计算多糖含量。

1.2.3 小鼠负重游泳实验 72只雌性小鼠随机分为正常组、阳性对照(灵芝西洋参口服液，3 ml/kg)组、PRR(200、400、800 mg/kg)组、SRR(200、400、800 mg/kg)组，正常组灌胃給予相同体积的生理盐水，给药组給予相应的药物，每日1次。连续灌胃20 d，最后1 d灌胃结束后将小鼠置游泳箱中游泳。水深不少于30 cm，水温(25±1.0) ℃，鼠尾根部负荷5%体质量的铅皮。记录小鼠自游泳开始至沉入水底10s不动为小鼠游泳时间。

1.2.4 小鼠自由游泳实验 54只小鼠随机分为正常组、模型组、阳性对照(灵芝西洋参口服液，3 ml/kg)组、PRR组(200、400、800 mg/kg)。正常组、模型组灌胃給予相同体积的生理盐水，给药组給予相应的药物，每日1次。连续灌胃PRR 20 d，最后1次灌胃后，将小鼠置游泳箱中自由游泳30 min，麻醉小鼠摘除眼球取血，离心得血清，4 ℃保存待测磷酸肌酸激酶(CK)、血清尿素氮(BUN)、乳酸(Lac)、乳酸脱氢(LDH)等生化指标。另取小鼠右腿腓肠肌测定肌糖原，同时迅速取肝脏，生理盐水清洗，测定肝糖原和SOD、CAT、GSH和MDA等生化指标。

2 结果

2.1 多糖含量的测定

硫酸-蒽酮显色法显示，PRR中的多糖含量为(72.13%±0.45)%，SRR中的多糖含量为(12.45%±0.15)%。

2.2 PRR和SRR对小鼠体质量的影响

表1显示，PRR和SRR给药组小鼠体质量与正常组小鼠体质量比较差异无统计学意义，说明PRR和SRR对小鼠的体质量不会产生影响。阳性对照组、PRR各剂量组小鼠负重游泳时间明显长于正常组 (P<0.01)，并呈剂量依赖性。SRR 800 mg/kg剂量组小鼠负重游泳时间明显长于正常组 (P<0.05)，其余剂量组的负重游泳时间有所提高，差异无统计学意义。

表1 PRR和SRR对小鼠体质量的影响

注：与正常组比较:*P<0.05,**P<0.01

2.3 PRR对自由游泳小鼠的血糖、肌糖原和血清尿素的影响

表2显示，模型组小鼠血清中的血糖和肌糖原较正常组明显降低，而血清尿素明显升高(P<0.01)，灵芝西洋参口服液组和PRR不同剂量组小鼠血清中的血糖和肌糖原较模型组均明显升高，血清尿素明显降低 (P<0.05)并呈剂量依赖性。

表2 PRR对小鼠血糖、肌糖原和血清尿素的影响

注：与正常组比较:##P<0.01；与模型组比较:*P<0.05,**P<0.01

2.4 PRR对自由游泳小鼠的乳酸、乳酸脱氢酶和肌酸激酶的影响

表3显示，模型组小鼠经过自由游泳30 min后，乳酸、乳酸脱氢酶和肌酸激酶含量较正常组显著增加(P<0.01)；灵芝西洋参口服液组、PRR不同剂量组小鼠血清中的乳酸、乳酸脱氢酶和肌酸激酶含量较模型组明显下降(P<0.01)。

表3 PRR对小鼠的乳酸、乳酸脱氢酶和肌酸激酶的影响

注：与正常组比较:##P<0.01；与模型组比较:*P<0.05,**P<0.01

2.5 PRR对游泳小鼠体内抗氧化效果

表4显示，模型组小鼠经30 min游泳后，与正常组小鼠比较，MDA的含量明显升高(P<0.01)，SOD、CAT和GSH的含量显著降低(P<0.01)；灵芝西洋参口服液组、PRR不同剂量组MDA含量较模型组明显下降(P<0.01)， SOD、CAT和GSH的含量明显增加(P<0.01)并呈剂量依赖性。

表4 PRR对小鼠体内抗氧化的影响

注：与正常组比较:##P<0.01；与模型组比较:*P<0.05,**P<0.01

3 讨论

众所周知，肌肉运动易引起ATP的快速消耗，而能量缺乏是身体疲劳的一个关键的表现因素。在中度至高强度运动期间，血清葡萄糖主要用于支持能量需求且很快耗尽，而连续运动通常导致低血糖，并抑制中枢神经系统的功能，进而降低连续运动能力。因此，血清葡萄糖的量可用于表示疲劳发展的速度和程度。此外，在体育锻炼期间，能量也可以源自糖原的分解。因此，恢复肌糖原对延长运动是有益的[5]。当身体不能从碳水化合物和脂肪中获得维持机体必须的能量时，蛋白质和氨基酸可以作为能源需求的替代能源，但是蛋白质和氨基酸的分解代谢会产生大量的尿氮素，并进一步影响肌肉的收缩力，严重时出现疲劳。本研究结果表明，PRR可以提高肌糖原的积累作用，提高血糖，降低尿素氮水平，这种能量代谢的调节方式在长时间的运动中是有利的。

乳酸是体内葡萄糖的代谢过程中产生的中间产物。当运动相对过度时，肌肉产生的乳酸不能在短时间内进一步分解，同时氧气供应不足将导致大量乳酸的堆积[6]。乳酸的积累将导致肌肉组织的pH降低从而导致疲劳，并阻碍运动性能。本研究中，PRR能显著降低小鼠血清乳酸，表明PRR能有效抑制乳酸的积累，从而延缓疲劳的发生。研究显示，剧烈运动易产生过量的自由基，并导致肌细胞产生损伤，部分LDH和CK渗入血浆[7]。 其中LDH是参与厌氧糖酵解和糖异生的重要酶，能促进丙酮酸和L-乳酸之间的氧化还原反应[8]。CK可以参与磷酸肌酸的合成，为细胞中快速的能量来源。在本研究中，PRR组中LDH和CK的水平显着降低，表明PRR的抗疲劳作用可能是由于其在强烈运动期间保护细胞免受损伤。

文献显示，脂质过氧化能直接反映细胞膜的氧化损伤，其中MDA是自由基膜脂质过氧化的主要产物[9]，而 SOD是一种抗活性氧的重要抗氧化酶[10]。另外GSH可通过清除自由基将有毒物质转化为无害的产物。因此，增加SOD活性、提高GSH水平、降低MDA的含量可以减轻氧化应激和改善运动诱发的疲劳。在本研究中，PRR能显著改善SOD活性，提高GSH水平，同时减少MDA含量，表明PRR能够保护细胞免受脂质氧化。

总之，刺梨多糖能通过提供能源物质和减少不利物质过多代谢，并通过较强的抗氧化共同消除疲劳，可以为刺梨的开发提供参考。

参考文献：

[1] HUANG LZ,HUANG BK,QIN LP. Progress on the mechanism and anti-fatigue function of traditional Chinese medicine[J]. Drugs Clin,2010, 25(11)： 161-166.

[2] HUANG LZ,HUANG BK,YE Q, et al. Bioactivity-guided fractionation for anti-fatigue property of Acanthopanax senticosus[J]. J Ethnopharmacol, 2011, 133(1)： 213-219.

[3] FAN LD,ZHAI F,SHI DX,et al. Evaluation of antioxidant

properties and anti-fatigue effect of green tea polyphenols[J].Res Essays,2011, 6(13)： 2624-2629.

[4] 李吉萍,孙婷婷,胡天骄.板蓝根活性组分对小鼠耐缺氧及抗疲劳作用的实验研究[J]. 中国药理学通报, 2016, 32(5): 712 -715.

[5] JIN HM,WEI P. Antifatigue properties of tartary buckwheat extracts in mice[J].Int J Mol, 2011, 12(8): 4770-4780.

[6] CHEN YM,TSAI YH,TSAI TY,et al. Fucoidan supplementation improves exercise performance and exhibits anti-fatigue action in mice[J]. Nutrients, 2014, 7(1)： 239-252.

[7] LEE SH, KIM IB,KIM JB, et al. The effects of Korean mistletoe extract on endurance during exercise in mice[J]. Anim Cells Syst,2014, 18(1): 34-40.

[8] JIN HM,WEI P.Anti-fatigue properties of tartary buckwheat extracts in mice[J]. Int. J. Mol, 2011, 12(8)： 4770-4780.

[9] 杨爱华, 申伟华, 蔡建光, 等.牛磺酸对丙二醛诱导疲劳大鼠的保护作用[J].北京体育大学学报, 2011, 34(3): 71 -74.

[10] MESTRE AA,FERRER MD,SUREDA A,et al. Phytoestrogens enhance antioxidant enzymes after swimming exercise and modulate sex hormone plasma levels in female swimmers[J]. Eur J Appl. Physiol, 2011, 111(9)： 2281-2294.