山豆根对沙尘所致慢性咽炎NF-kb信号传导通路的影响作用❋

王 莉，刘雨娟，姚 兰，蔺兴遥

(1. 河西学院医学院，甘肃 张掖 734000； 2. 甘肃中医药大学科研实验中心，兰州 730000)

沙尘暴发生时大量的细颗粒物被扬起，同时在细颗粒物形成和长途传输过程中发生了大量的化学和生物学污染，对大气和人体健康带来极大的危害[1]。河西走廊至内蒙古中西部﹑宁夏干旱区既是我国沙尘暴最主要的源地区，也是受沙尘暴影响最主要的地区。《素问·阴阳应象大论》说“天气通于肺”“鼻为肺之窍”“喉为肺之门户”，故咽喉的解剖部位决定了沙尘中的致病颗粒物易滞留在咽部，诱发咽部疾患。山豆根性寒味苦，具有清火解毒﹑消肿止痛的功效[2]，临床常用治疗咽喉肿痛、牙龈肿痛等。我们前期的临床研究也证实，以山豆根为君药的中药复方对河西地区沙尘引发咽炎的治疗有较好的疗效。目前有关河西地区沙尘颗粒物引发慢性咽炎及山豆根水煎剂治疗此类疾患的作用机制报道甚少，因此本实验是初步探讨了山豆根在治疗河西地区沙尘颗粒物所诱发的慢性咽炎中的作用及其机制。

1 研究材料

1.1 实验动物

健康SPF级成年SD大鼠，雌雄各半共60只，体质量(200±20) g，由甘肃中医药大学科研实验中心提供。

1.2 主要试剂

依那西普由辉瑞制药有限公司提供；TNF-a、IL-1、IL-6、MDA、T-AOC、NF-KB试剂盒由西安科昊生物工程有限责任公司提供，山豆根水煎液由甘肃中医药大学科研实验中心中药前处理室提供。

1.3 主要仪器

酶联免疫分析仪(BIO-TEC,U.S.A)；紫外分光光度计(UV-2401PC,日本)。

2 研究方法

2.1 沙尘模拟实验方法

沙尘模拟实验平台由甘肃省人民医院、中科院寒旱所联合研制。沙尘采用减速法，从兰州市市中心以及郊区10个采集点收集，降尘缸外围安装减速沿,自降尘缸向外高度逐渐降低。采集的沙尘主要成分为MgO、CaO、Na2O，沙尘由兰州市环保局空气质量监测站点提供。

2.2 分组方法

将60只大鼠按随机数字表法分为4组，正常对照组：于沙尘模拟实验平台给予正常吹风2 h/d，不吸入沙尘，第31天开始每天以生理盐水灌胃1 ml/100 g；沙尘模型组于沙尘模拟实验平台沙尘吹风2 h/d，风速8 m/s共45 d，沙尘来自室外；依那西普组从造模后的第31天、第38天、第45天按剂量皮下注射依那西普3次；山豆根组于造模后的第31天开始每天灌胃给予相应剂量的药物。

最后1 d给药后2 h，各组大鼠以戊巴比妥钠0.4 ml麻醉，股动脉采血分离血清，使用3000R离心机离心10 min，取上层血清与-20 ℃冰箱保存，采用酶联免疫法测定TNF-a、IL-1、IL-6、NF-kb含量，检测方法均严格按照试剂盒说明操作。

采血后剪取咽部组织约0.8～1 g 2份，一份用分光光度法检测MDA、T-AOC含量,一份用于病理组织切片，组织取材后迅速投入10%中性福尔马林中固定，使用乙醇脱水、二甲苯透明、浸蜡，常规石蜡包埋切片HE染色(HE染色×400)。

2.3 实验药物浓度计算方法

沙尘颗粒物(直径≤10 um，PM10)主要成分为MgO、CaO、Na2O，浓度水平>167.5 μg/m3。山豆根水煎液，成人日服用量按药典为0.086 g生药/kg，大鼠灌胃剂量按成人6倍计算为0.52 g/kg，临用前以蒸馏水配置成浓度为5.2%的溶液冰箱保存备用。依那西普冻干粉剂，临床成人治疗剂量为0.36 mg/kg,每周1次；大鼠腹部皮下注射剂量按成人6倍计算为2.16 mg/kg。

2.4 统计学方法

3 结果

3.1 大鼠血清中IL-1、IL-6、TNF-a、NF-kb表达的变化

表1显示，与正常对照组比较，沙尘组中IL-1、IL-6、TNF-a、NF-kb水平均明显升高，差异有统计学意义(P<0.05)；与沙尘组比较，依那西普组和山豆根组中IL-1、IL-6、TNF-a、NF-kb水平均明显降低，差异有统计学意义(P<0.05)；依那西普组与山豆根组比较，以上指标差异无统计学意义(P>0.05)，说明沙尘颗粒物可引发慢性咽炎中促炎因子的表达，而山豆根和依那西普均能抑制沙尘颗粒物促炎因子的表达，并下调沙尘颗粒物引发慢性咽炎中NF-kb水平表达。

表1 各组大鼠血清中IL-1、IL-6、TNF-a、NF-kb表达情况比较

注：与正常对照组比较：*P<0.05；与沙尘模型组比较：#P<0.05

3.2 大鼠咽部组织MDA、T-AOC含量变化

表2显示，与正常对照组比较，沙尘组中MDA水平明显升高，而T-AOC含量降低，差异有统计学意义(P<0.05)；与沙尘组比较，依那西普组和山豆根组中MDA水平均明显降低，而T-AOC含量降低，差异有统计学意义(P<0.05)；依那西普组与山豆根组比较，以上指标差异无统计学意义，说明沙尘颗粒物引发慢性咽炎时，引起机体抗氧化能力降低，山豆根和依那西普可通过增强机体的抗氧化能力，以阻断沙尘颗粒物对咽部组织的损伤作用。

表2 各组大鼠咽部组织MDA、T-AOC含量比较

注：与正常对照组比较：*P<0.05；与沙尘模型组比较：#P<0.05

3.3 咽部组织形态结构的改变

图1显示，正常对照组大鼠咽部组织结构清晰，黏膜上皮光滑，黏膜上皮层多为未角化的复层扁平上皮，固有层可见散在淋巴组织和腺泡，腺体结构正常，致密结缔组织，黏膜下有少量小血管，肌层纤维排列规则。未见明显的上皮增生，大部分未见血管扩张、水肿、炎性细胞浸润与纤维组织增生。肌肉层以及外膜都未明显炎性改变。沙尘模型组大鼠咽部组织分界不清，上皮层为角化的复层扁平上皮，见明显的增生，固有层和黏膜下水肿，小血管增多、充血，大量炎性细胞浸润(主要为淋巴细胞以及单核细胞)，少量深入肌层组织，肌纤维排列不规则。纤维组织增生，黏膜下层为疏松结缔组织，可见腺体肥大、增生、萎缩等，周围可见血管数量最多、炎性细胞密集性浸润。肌肉层、外膜层未见明显的炎性改变。造模成功。依那西普组与山豆根组：黏膜上皮逐渐恢复平整，黏膜上残留少量黏液，黏膜和黏膜下可见少量炎性细胞浸润。上皮层、固有层病变程度与模型组比较有明显的改善，肌肉层、外膜层的炎性改变明显减轻，说明依那西普和山豆根均能抑制沙尘颗粒物对眼部组织所致慢性病理性变化。

图1 各组大鼠咽部组织形态结构改变(10×40)

4 讨论

慢性咽炎为上呼吸道慢性炎症，其病理改变主要为黏膜慢性充血，血管周围淋巴细胞、白细胞浸润，黏膜及黏膜下结缔组织增生，腺体肥大，黏液分泌增多。研究表明，慢性炎症性疾病发生与发展中，TNF-a、IL-1、IL-6参与其中并过量表达[3]。这与本实验中沙尘颗粒物引发慢性咽炎的结果一致。同时TNF-a、IL-1、IL-6作为细胞外刺激因子，又可激活NF-kb进一步放大炎症反应[4]。在沙尘暴颗粒物中，部分不但本身具有自由基活性，还可促进活性氧(ROS)和活性氮(RNS)释放，从而对细胞膜产生脂质过氧化，破坏组织的氧化-抗氧化系统的平衡，导致氧化损伤[5]。丙二醛是脂质过氧化的终末反应产物，过多的脂质过氧化物可导致机体的总抗氧化能力减弱，而ROS和RNS的过量产生在炎症反应的组织损伤中发挥重要作用。山豆根当前的化学成分主要为生物碱、黄酮、木脂素，现代药理学研究证实其有抗病毒、抗炎、抗氧化等药理学活性。山豆根中的紫檀素类黄酮与二氢黄酮，能够诱导巨噬细胞RAC产生炎症介质NO，山豆根多糖能够直接清除超氧阴离子及羟自由基，同时抑制H2O2释放[6]。这与本实验结果一致，因此推测山豆根可能通过降低促炎因子及ROS的表达，增强机体的抗氧化能力以阻断沙尘颗粒物所致的咽部炎症损伤反应。

TNF-a是一种具有多种生物学效应的细胞因子，其与TNF-Rl结合后，使NF-kb发生磷酸化、泛素化而活化，激活的NF-kb进入核内诱导促炎症因子(TNF-a、IL-1、IL-6)、趋化因子(IL-8)等炎性基因及VEGF、TGF-β等基因的表达，参与炎症反应，TNF-a激活NF-kb介导信号通路是炎症级联反应放大的基础[8]。依那西普是可溶性肿瘤坏死因子受体p75和免疫球蛋白fc段的融合蛋白，为TNF-a拮抗剂，通过抑制TNF-a与TNF-Rl结合起到控制炎症的作用。本实验选用依那西普后，明显抑制沙尘颗粒物引发咽部组织的慢性炎症反应和氧化损伤；沙尘组中随着NF-kb通路中的2个上游分子TNF-a、IL-1表达的显著上调，NF-kb的表达也显著上调；而山豆根组中当TNF-a、IL-1的表达明显下调时，NF-kb的表达也明显下调，差异有统计学意义。因此推测TNF-a介导的NF-kb信号通路激活可能是沙尘颗粒物引发咽部炎症损伤的重要因素之一；山豆根治疗沙尘颗粒物诱发慢性咽炎的机制，可能是其中生物碱、黄酮成分能够增强降低TNF-a的表达而抑制NF-kb信号通路的活化，降低TNF-a、IL-1、IL-6水平，避免炎症反应放大，减轻炎症因子对细胞膜的脂质过氧化损伤，从而减轻咽部炎症反应和机体的氧化损伤反应[9]。

山豆根治疗沙尘颗粒物所致慢性咽炎的作用机制可能是通过TNF-a受体介导的信号传导途径，下调核转录因子-kb的表达水平而发挥作用。今后可进行有效成分的筛选，以山豆根提取物作为原料，用于药剂进行沙尘地区咽炎防治新药研发。但是本次研究只使用山豆根常规剂量作为研究剂量，以明确其对沙尘所致慢性咽炎NF-kb信号传导通路的影响，而未使用多个对比剂量进行研究，因此需要更进一步针对不同剂量进行深入研究。

参考文献：

[1] 姜德,周铭心,韩荣，等.慢性咽炎与西北燥证相关性病例的对照研究[J]. 中国中医基础医学杂志, 2012，18(11)：1224-1226.

[2] 国家药典委员会.中国药典[M]. 北京：化学工业出版社, 2005.

[3] 杨振华，孟紫强,等.沙尘天气可吸入颗粒物对气管炎门诊就诊数的影响[J].环境与职业医学,2013,30(2):88-90.

[4] VASILIOU V，LEE J，PAPPA A，PETERSEN DR．Involvement of p65 in the regulation of NF-kB in rat hepatic stellate cells during cirrhosis[J]．Biochem Biophys Res Commun,2000,273(2)：546-550．

[5] 张全喜，孟紫强.沙尘暴细颗粒物的DNA损伤及氧化应激作用[D].太原：山西大学环境科学与工程研究中心,2005：12-15.

[6] 彭红华，黄健,等.山豆根颗粒物及其饮片抗炎作用及其机制的研究[J]. 中国实验方剂学杂志, 2013， 19(12):265-269．

[7] ABAL-HIERROL，RODRIGUEZM, ARTIME, et al．TRAF-mediated modulation of NF-kb and JNK activation by TNFR[J]. Nature, 2000,18(2)：304．

[8] 王成功,董光荣，等.沙尘暴研究进展[J]. 中国沙漠, 2000，20(4)：349-356.

[9] 陈魁,王立华.杨国登，等.中医药治疗慢性肥厚型咽炎的临床探讨[J]. 中国中医基础医学杂志, 2011，17(4)：419-421.