健脾化痰汤对大鼠脂肪肝炎症及巨噬细胞分化的影响❋

薛 欣，李玉梅，李海玉，陈 冰，张立石，马雅銮

(中国中医科学院中医基础理论研究所，北京 100700)

非酒精性脂肪性肝病(nonalcoholic fatty liver disease,NAFLD)是一种无过量饮酒史，由各种原因引起的肝细胞内脂肪堆积，以肝细胞脂肪变性和脂质蓄积为主要特征的临床病理综合征。目前公认的NAFLD发病机制为“二次打击”学说[1]。“二次打击”学说表明，炎症反应在NAFLD发生发展过程中起很重要的作用。近年来的研究表明，脂肪肝组织中存在着慢性炎症。其特点一是与炎症反应相关的脂肪因子(adipokine)合成异常[2]；二是急性期反应物增多，如C-反应蛋白(C response protein，CRP)[3]等；三是炎症信号网络激活、过度表达促炎性和炎性介质，如白细胞介素(inferleukin，IL)- 6、肿瘤坏死因子(tumor necrosis factor，TNF)-α、细胞间黏附分子(intercellular cell adhesion molecule，ICAM)-1、单核细胞趋化因子(monocyte chemoattractant protein， MCP)-1等[4]；四是肝巨噬细胞(Kuppfer细胞)聚集、极化与NAFLD有密切关系[5-6]。

脾虚生痰是脂肪肝形成的重要病机之一。临床应用健脾化痰法治疗脂肪肝具有较好疗效[7-9]。健脾化痰汤(二陈汤与四君子汤的和方)具有健脾、化痰之功效。本研究以高脂饲料联合脂肪乳灌胃复制大鼠脂肪肝模型，观察健脾化痰汤对血清C-反应蛋白、肝组织炎症因子的影响，从巨噬细胞极性的角度探讨炎症在健脾化痰汤防治肝细胞脂肪变性中的作用。

1 材料与方法

1．1 动物

清洁级SD 雄性大鼠40只，体质量(200±20 g)，由中国人民解放军军事医学科学院实验动物中心提供(SCXK(军)2012-0004)，饲养于中国中医科学院中医基础理论研究所动物实验中心(为清洁级动物室)。

1．2 药物和试剂

易善复多烯磷脂酰胆碱胶囊(国药准字H20059 010)购于赛诺菲安万特制药有限公司；脂肪乳(20%猪油，10%胆固醇，2%胆盐，1%丙基硫氧嘧啶)，其中猪油自备，胆固醇(批号20130626)、胆盐(批号20120410)、丙基硫氧嘧啶(批号20130307)购于国药集团化学试剂有限公司；C反应蛋白(CRP) ELISA试剂盒购于南京建成生物工程研究所；RNA 提取试剂盒购于德国Qiagen公司；实时荧光定量PCR探针GAPDH、MCP1、干扰素γ(IFNγ)、白介素-4(IL-4)、白介素-10(IL-10)由美国Life Technology公司合成；逆转录试剂盒和实时荧光定量PCR试剂盒购于美国ABI公司；7500 Real-time PCR仪为美国ABI公司产品。

1．3 药物制备

健脾化痰汤的组成：党参9 g，白术9 g，茯苓9 g，甘草6 g，法半夏15 g，陈皮15 g，生姜3 g，乌梅1枚。所有药材均购自北京同仁堂药业股份有限公司，水煎剂浓缩至折合原药材浓度1.0 g/ml(相当于70 kg成人临床等效剂量的8倍)。易善复(多烯磷脂酰胆碱)溶液制备：以相当于70 kg成人临床等效剂量8倍，用蒸馏水溶解制成易善复溶液。脂肪乳的制备：将20%猪油、10%胆固醇、2%胆盐、1%丙基硫氧嘧啶按比例搅匀。

1．4 方法

1．4．1 分组、造模及给药 将实验动物按体质量均衡和随机原则分为正常对照组、模型组、健脾化痰汤组和易善复组各10只。正常组大鼠给予维持期饲料饲养、自由饮水，模型组和给药组大鼠均按0.5 ml/只/d的量灌胃脂肪乳,连续造模8周。自造模之日起，健脾化痰汤组给予含生药1.0 g/ml的浓缩液灌胃，易善复组作为阳性对照药，以相当于70 kg体质量成人临床用药量8倍的量灌胃，各给药组按1 ml/100 g体质量灌胃，每日1次，连续给药8周。正常组、模型组给予等体积蒸馏水灌胃。各组大鼠于造模给药结束后处死，留取肝组织标本及下腔静脉取血。

1．4．2 计算肝脏指数 经左心室插管注入冰生理盐水对肝脏灌流，沥干水分称肝重。计算肝脏指数=肝湿重/体质量×100%。

1．4．3 血清生化测定 下腔静脉取血10 ml，室温静止，4000 r/min 离心20 min，迅速分离血清， -80 ℃冰箱保存。用全自动生化分析仪(日本Olympus AU400)检测肝功能指标，如天冬氨酸转氨酶(AST)、丙氨酸转氨酶(ALT)含量；检测血脂指标，如总胆固醇(TC)、总甘油三脂(TG)、高密度脂蛋白(HDL)、低密度脂蛋白(LDL)含量；检测血清中C-反应蛋白(CRP)含量，测定方法按试剂盒说明书进行。

1．4．4 实时定量PCR(探针法)检测肝组织炎症因子、脂肪因子基因表达 采用RNeasy Plus Micro Kit提取RNA并溶于20ulRNAase-free H2O中，测定RNA纯度和浓度。反转录采用High Capacity RNA-to-cDNA 试剂盒,总体系为20ul，其中RNA溶液10μl，反应条件25 ℃ 10 min，37 ℃ 120 min，85 ℃ 5 min；4 ℃冷却，RT-PCR采用Gene Expression Master Mix 试剂盒及GAPDH、MCP1、IFNγ、IL-4、IL-10探针和ABI 7500型基因扩增仪，总体系20 μl，其中10 μl Master Mix，8 μl ddH2O，1μl探针，1μl cDNA 模板，扩增条件:50 ℃ 2 min，95 ℃ 预变性 10 min，95 ℃ 15 s，60 ℃退火延伸60 s，共60个循环。以内源性GAPDH作参照，使用ABI SDS 7500 software 软件进行结果分析。

2 结果

2.1 各组大鼠肝脏指数及血清肝功能、CRP比较

表1显示，与正常对照组比较，模型组大鼠肝脏指数明显升高(P<0.01)，而健脾化痰组(P<0.05)、易善复组(P<0.05)肝脏指数较模型组降低。

表1 大鼠肝脏指数、血清ALT、AST比较

注：与对照组比较:aaP<0.01；与模型组比较:bP<0.05，bbP<0.01

表1显示，与正常对照组比较，模型组大鼠血清中ALT、AST含量略有增高，但差异无统计学意义；健脾化痰组、易善复组ALT、AST含量较模型组均有下降趋势，健脾化痰组的ALT(P<0.01)、AST(P<0.05)及易善复组的AST(P<0.05)下降较为明显，差异有统计学意义。提示虽然模型组大鼠并无明显肝功能改变，健脾化痰汤、易善复亦可对肝功能有不同程度改善作用。

表1显示，与正常对照组比较，模型组大鼠血清中CRP含量明显增高(P<0.01)，可达对照组的2.5倍；CRP作为急性时相反应蛋白，是一种非特异性的炎症标志物，与急慢性炎症性疾病密切相关。模型组CRP含量的增高提示机体处于炎症状态。健脾化痰组、易善复组CRP含量较模型组均下降明显(P<0.05)，提示给药组可不同程度地抑制炎症状态。

2.2 各组大鼠血脂含量的变化

表2显示，与正常对照组比较，模型组大鼠血清中TC、LDL含量明显增高(P<0.01)；TG含量略有增高，但差异无统计学意义(P>0.05)。HDL含量虽仅有下降趋势，但HDL/TC明显低于对照组(P<0.01)，提示模型组大鼠存在严重的脂质代谢紊乱。与模型组大鼠比较，健脾化痰组TG含量明显降低(P<0.05)、HDL/TC明显提高(P<0.05)，TC、LDL含量仅有下降趋势，但差异无统计学意义(P>0.05)，这可能与灌胃脂肪乳中含有胆固醇有关，提示健脾化痰汤可明显抑制由高脂饲料联合脂肪乳灌胃引起大鼠血脂水平的增高。

表2 大鼠血清中TC、TG、LDL、HDL和HDL/TC含量比较

注：与对照组比较:aaP<0.01；与模型组比较:bP<0.05

2.3 大鼠肝组织炎症因子的mRNA表达

表3显示，与正常对照组比较，模型组大鼠肝组织中MCP1、IFNγ mRNA的表达明显增高(P<0.05)，IL-10 mRNA有下降趋势，但差异无统计学意义(P>0.05)；IL-4的表达与对照组比较无明显差异。与模型组比较，健脾化痰组大鼠肝组织中IL-4、IL-10的mRNA表达增高，差异有统计学意义(P<0.05)；MCP1、IFNγ的mRNA表达有下降趋势，但差异无统计学意义(P>0.05)；与模型组比较，易善复组大鼠肝组织中IL-4、IL-10的mRNA表达增高更为明显，差异有统计学意义(P<0.01)；MCP1、IFNγ mRNA的表达有下降趋势，但差异无统计学意义(P>0.05)。

表3 大鼠肝组织中炎症因子的mRNA表达(Ratio)

注：与对照组比较:aP<0.05；与模型组比较:bP<0.05，bbP<0.01

3 讨论

脾虚生痰是脂肪肝形成的重要病机之一，脾主运化、统血、主升清，脾主运化体现在两个方面，一是运化水谷精微，二是运化水湿。而饮食不节则会损伤脾胃，使脾的运化功能受损，不能正常消化饮食和转输水液，导致痰湿内生、蕴结于肝而发本病。临床亦证实，应用健脾化痰法治疗脂肪肝具有较好疗效[7-9]。健脾化痰汤为《太平惠民和剂局方》中的二陈汤与四君子汤的和方，兼具健脾、化痰之功效。

目前公认的NAFLD的发病机制是1998年Day等[1]提出的“二次打击”学说，即初次打击由IR和高胰岛素血症导致的肝脏脂质沉积，二次打击为氧化损伤、炎症反应进一步引起的脂肪性肝炎、肝纤维化、肝硬化等过程。参与二次打击的炎症反应在NAFLD发生发展过程中起重要作用。

C-反应蛋白主要由肝细胞和成熟的脂肪细胞合成及分泌，其表达受炎症因子的调控，如TNF-α、IL-1β等与IL-6的关系最为密切。CRP是急性期反应蛋白的一种，是机体重要的防御分子，也是非特异性炎症标志物之一，与急慢性炎症性疾病密切相关，具有诱导单核、巨噬细胞黏附、聚集、活化和细胞因子、ROS产生的作用[3、10]。实验结果显示，模型组大鼠血清中CRP含量明显高于对照组，提示机体可能处于炎症状态。健脾化痰组血清CRP含量较模型组明显下降，提示健脾化痰汤可以抑制由高脂饮食引起的机体炎症状态，健脾化痰汤对脂肪肝的抑制作用亦可能与其抗炎作用有关。

由“二次打击”学说可看出，细胞因子在NASH的发病机制中起很重要的作用。肝组织中的巨噬细胞(Kuppfer 细胞)是细胞因子产生的重要来源，巨噬细胞根据诱导因素、受体表达、分泌细胞因子及功能的不同分为两类，即经典活化型(classically activated macrophages，M1型)和替代活化型(alternatively activated macrophages，M2型)。IFNγ是M1型巨噬细胞的诱导因子，MCP1是M1型巨噬细胞分泌的细胞因子，具有招募炎性巨噬细胞的作用[11]；IL-4是M2型巨噬细胞的诱导因子，IL-10是M2型巨噬细胞分泌的细胞因子。M1型巨噬细胞促进炎症反应，M2型巨噬细胞具有抑炎作用[6、12]。实验结果显示，模型组大鼠肝组织中M1型诱导因子(IFNγ)和分泌因子(MCP1)的表达明显增高，而模型组M2型诱导因子(IL-4)无明显变化，M2型分泌因子(IL-10)有下降趋势，说明模型组大鼠肝组织中巨噬细胞向M1型分化。健脾化痰组大鼠肝组织中M2型因子IL-4、IL-10表达明显增高，而M1型因子MCP1、IFNγ的表达仅有下降趋势，即健脾化痰组大鼠肝组织中有利于M2型巨噬细胞分化的Th2型细胞因子的产生增高。在炎症反应过程中，M1型和M2型巨噬细胞极化的动态改变调节天然免疫参与的各种炎症反应[13]，提示健脾化痰汤抑制高脂饮食引起的非酒精性脂肪肝作用可能是通过促进巨噬细胞向M2型分化，从而抑制炎症反应。

综上所述，长期高脂饮食加脂肪乳灌胃可造成大鼠机体处于(慢性)炎症状态，健脾化痰汤对机体(慢性)炎症状态有一定的缓解作用，健脾化痰汤对肝脏的保护作用亦可能与促进巨噬细胞M2分化有关。

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