多聚ADP-核糖结合蛋白的鉴定

沈莉芳,张 弛,吴家雪

(复旦大学 生命科学学院，上海200438)

ADP-核糖基化是一种在高等真核生物中普遍存在的蛋白翻译后修饰．该修饰由ADP-核糖基转移酶家族的成员催化，从底物β-NAD+转移ADP-核糖部分到受体蛋白上，从而调节这些蛋白的功能．ADP-核糖基团可以以单个的ADP-核糖(MAR)或以聚合链多聚ADP-核糖(PAR))的形式存在．目前已经发现PAR在染色质重塑、DNA损伤修复、基因转录、蛋白质降解和细胞死亡中发挥重要作用[1-3]．

PAR的功能除了调节底物外，还可以作为介导两个蛋白之间相互作用的平台起作用．例如，许多DNA损伤应答因子，如ALC1[4-5]和CHFR[6]在DNA损伤时能够被招募到DNA损伤位点，这种募集作用取决于它们与DNA损伤位点上被PAR修饰蛋白的结合，并且能被ADP-核糖基转移酶(poly(ADP-ribose)polymerases, PARPs)抑制剂抑制．这种相互作用主要由PAR和PAR结合结构域的结合来介导．目前已经报道了一些PAR结合结构域．这些结构域包括Marco结构域[4]，WWE结构域[7]，PAR结合锌指结构域(PBZ)[6,8-10]，BRCT结构域[11]，FHA结构域[11]，OB-折叠结构域[12]，PIN结构域[13]和RNA识别基序(RRM)[14]．

鉴定PAR修饰蛋白或PAR结合蛋白对于探索PAR的功能非常重要．但是由于目前大规模检测PAR修饰位点技术的缺乏，在文献和数据库中报道的PAR修饰蛋白或PAR结合蛋白还比较少．基于质谱的蛋白质组学已经成为鉴定复杂的PAR结合蛋白的关键技术[15-17]．最近有研究表明利用抗体，PAR结合结构域或NAD+类似物沉淀相关的PAR修饰蛋白，并进行质谱分析可以得到大量的PAR修饰或者PAR结合蛋白[18-22]．然而，通过这些方法鉴定的蛋白绝大部分是被PAR修饰的蛋白，缺少直接与PAR结合蛋白的信息．

本论文中，我们通过利用PAR修饰的PARP1或PARP1分别进行pull-down试验和质谱分析来比较分别与PARP1或PAR-PARP1结合的蛋白，得到PAR特异结合蛋白．结果表明，我们鉴定到大量PAR结合蛋白，并进行进一步的验证．

1 材料和方法

1.1 材料

1.1.1 细胞系和质粒

人肾上皮细胞来源的HEK 293T细胞系和人肝癌细胞来源的QGY-7703细胞系获自中国科学院上海细胞库．载体pGEX-4T-1或修饰的SBP载体由本实验室保存．

1.1.2 主要试剂

DNA聚合酶，限制性内切酶，T4DNA连接酶体系(New England Biolabs)，质粒小量抽提试剂盒，PCR产物纯化试剂盒和柱离心式凝胶回收纯化试剂盒(Axygen)，谷胱甘肽琼脂糖珠4B(Amersham),胎牛血清(Gibco),100U/mL青霉素和100μg/mL链霉素(Euroclone),DMEM培养基(Hyclone),辣根过氧化物酶偶联羊抗兔抗体(Calbiochem)，抗体抗-PAR多抗(Thermo)，ECL显色试剂盒(Santa Cruze).

1.1.3 siRNA

HRP2干扰siRNA寡核苷酸购自上海吉玛生物公司．HRP-2的siRNA寡核苷酸正向序列是： si-HRP-2#1： 5’-GCCCAACAAGAGGAAAGGC-3’;si-HRP-2#2： 5’-GCUGCACAGUGAGAUCAAG-3’．阴性对照序列为： 对照： 5’-ACAGACUUCGGAGUACCUG-3’．根据说明书，使用Oligofectamine(Invitrogen)将siRNA转染入细胞．

1.2 方法

1.2.1 体外ADP-核糖基化

GST-PARP1融合蛋白与PAR核糖基化缓冲液(100mmol/L Tris-HCl(pH7.8)，12.5mmol/L NAD+，10mmol/L MgCl2，50μg寡脱氧核糖核苷酸(5’-GGAATTCC-3’)和10mmol/L DTT)或者不含NAD+的PAR核糖基化缓冲液混合，并于30℃条件下孵育30min．通过GST抗体或者PAR抗体进行免疫印迹分析PARP1的自我修饰．

1.2.2 PAR的合成和纯化

PAR合成缓冲液1mL(100mmol/L Tris-HCl pH 7.8, 10mmol/L MgCl2，12.5mmol/L NAD+，10mmol/L DTT，50μg寡脱氧核糖核苷酸(5’-GGAATTCC-3’)，100μg GST-PARP1)，37℃孵育1h，加入20mL预冷的20% TCA终止．加入DNA酶Ⅰ去除寡核苷酸DNA，并经蛋白酶K消化蛋白后，用乙醇沉淀并纯化[6]．

1.2.3 GST pull-down实验

收集HEK 293T细胞，用含有0.5% NP-40，100mmol/L NaCl，20mmol/L Tris-HCl(pH 8.0)和1mmol/L EDTA的细胞裂解缓冲液裂解细胞．将细胞裂解液与GST融合蛋白(GST-PARP1或被PAR修饰的GST-PARP1)在4℃孵育2h，然后加入谷胱甘肽琼脂糖珠4B再结合2h．通过离心的方法，收集谷胱甘肽琼脂糖珠，并用细胞裂解液将非特异结合的蛋白去除．加入SDS上样液，98℃加热10min后，进行SDS-PAGE电泳，并用考马斯亮蓝(CBB)染色．最后将相应的泳道进行切割，并送到质谱分析平台进行质谱鉴定．

1.2.4 蛋白的表达和纯化

按照之前报道的方法[6]在昆虫细胞中表达并纯化得到GST-PARP1蛋白．而GST-HRP2，CDK9，EWSR，FXR1，PWWP和PWWP突变蛋白在大肠杆菌E.coliBL21中表达并纯化．简而言之，将转入PGEX-4T-HRP2或其他基因的E.coliBL21培养到OD到0.6左右，加入异丙基-β-D-硫代半乳糖苷(IPTG)，并在20℃诱导表达诱导表达6h．离心收集细菌后，通过超声破碎细胞，高速离心后收集上清液体，再加入谷胱甘肽琼脂糖珠4B在4℃结合2h，然后用含有还原性谷胱甘肽的洗脱液将GST融合蛋白从谷胱甘肽琼脂糖珠4B洗脱下来，并通过SDS-PAGE凝胶电泳和考马斯亮蓝染色来分析融合蛋白．

1.2.5 斑点印迹和体外结合实验

将GST融合蛋白各2.5μL点样在0.22μm硝酸纤维素膜上，自然风干后，用1×TBST(20mmol/L Tris-HCl，0.3mmol/L NaCl，0.05% Tween-20，pH 8.0)配置的5%的脱脂牛奶在室温下封闭40min；室温下将PAR聚合物与结合GST融合蛋白的膜孵育1h，然后用含高浓度氯化钠(50mmol/L)的1×TBST洗膜4次，自然风干；将膜与用TBST稀释的抗PAR多克隆抗体(HRP标记)孵育1h，然后用TBST溶液洗膜3次，最后进行显色爆光．

1.2.6 细胞存活率测定

将细胞接种到60mm的培养皿上，然后分别用对照siRNA或HRP-2 siRNA转染．转染24h后，加入DNA损伤药物CPT或MMS处理细胞．每3天更换1次培养基，将细胞培养10d．通过比较培养皿中形成的细胞克隆数来计算存活的细胞数量．

1.2.7 统计分析

数据取自3个独立实验的均值±标准差．有意义的差异通过Studentt检验进行评估．P<0.05被认为具有统计学意义．

2 结 果

2.1 多聚ADP-核糖结合的蛋白的鉴定

从昆虫细胞中表达并纯化GST-PARP1，考马斯亮蓝染色表明获得的GST-PARP1比较纯，大小为140kDa左右，与预期一致(图1(a))．通过体外PAR反应，并分别利用PAR抗体和GST抗体进行Western blot分析，表明获得的GST-PARP1在体外具有很强的酶活性，几乎所有的GST-PARP1能够在体外进行自我PAR修饰(图1(b))．

为了鉴定PAR结合蛋白，我们将GST-PARP1或PAR修饰的GST-PARP1蛋白分别与HEK 293T细胞的裂解液孵育，然后用谷胱甘肽琼脂糖珠进行沉淀．通过质谱分析GST-PARP1和PAR修饰的GST-PARP1结合的蛋白．表1列出了部分质谱分析得到的特异与被PAR修饰的GST-PARP1结合的蛋白．在这些仅特异性结合PAR修饰的GST-PARP1的蛋白中，有部分已被报道与PAR结合，如SFPQ，NONO，FUS，TAF15，RBMX，PARP2，CHFR和ALC1[5-6,21,23-24]，部分是第一次发现与PAR结合．为了进一步验证这些蛋白与PAR的结合，我们表达并纯化了GST融合的CDK9，FXR2，EWSR1和HRP2蛋白(图1(c))．然后通过Dot blot方法体外检测GST-CDK9，FXR2，EWSR1和HRP2与PAR的相互作用，并用抗GST和抗PAR的抗体进行Western blot分析，结果表明这4个蛋白都能在体外与PAR结合(图1(d))．

图1 PAR结合蛋白的鉴定Fig.1 Identification of PAR-binding proteins(a) GST-PARP1的SDS-PAGE凝胶电泳及考马斯亮蓝染色；(b) Western blot验证GST-PARP1的体外自我修饰；(c) GST-CDK9,FXR1,HRP2和EWSR1的SDS-PAGE电泳及考马斯亮蓝染色；(d) Dot blot验证GST-CDK9, FXR1, HRP2和EWSR1与PAR体外结合.

编号蛋白名称+PAR-PAR是否已报道编号蛋白名称+PAR-PAR是否已报道1PARP1152164是14C22orf28101否2XRCC52323是15EWSR191否3XRCC62322是16FAM98A91否4SFPQ282是17PABPC190否5DDX3X271否18HNRNPUL181否6NONO192是19FXR170否7DDX5182否20FXR240否8FUS171是21FMR140否9SUPT16H172是22HRP230否10DDX1140否23ALC130是11KHDRBS1121否24CHFR30是12RBM14121否25CDK920否13TAF15120是

2.2 PWWP域是一个PAR结合结构域

在这些新的PAR结合蛋白中，HRP-2属于肝癌衍生生长因子相关蛋白家族(HDGF家族)．该家族包括HDGF，HDGFL1，LEDGF，HRP-2和HRP-3．该家族的蛋白在N末端都有保守的PWWP/HATH结构域[25-27]．之前，我们发现HRP-2和HRP-3在肝癌(HCC)细胞中上调，并促进HCC细胞的生长和存活，表明它们在肿瘤发生和发展中起重要作用[28-29]．有趣的是，有报道发现HDGF与PARP1相关[30]．我们还发现HDGF存在于PAR修饰的GST-PARP1结合的蛋白复合物中，而不存在于GST-PARP1结合的蛋白复合物中．HDGF和HRP-2在N末端都含有非常保守的PWWP结构域，暗示HRP-2与PAR的相互作用很大可能依赖于其PWWP结构域．

为了验证这一假设，我们构建了SBP标签标记的全长HRP-2(HRP-2 WT)和PWWP结构域缺失突变体HRP-2(HRP-2 MT)的质粒，并将其转染到HEK 293T细胞中．将PAR修饰的GST-PARP1分别与表达HRP-2 WT或HRP-2 MT的HEK 293T细胞的细胞裂解液共孵育，然后用谷胱甘肽-琼脂糖珠进行沉淀并用Flag抗体进行Western blot分析．如图2(a)所示，PAR修饰的GST-PARP1能与野生型的HRP-2相互作用，而不与PWWP结构域缺失突变体HRP-2相互作用，表明HRP-2的PWWP结构域是HRP2与PAR相互作用必需的．

为了进一步验证这一假设，我们克隆、表达并纯化了所有HDGF家族成员的PWWP结构域，并进行PAR体外结合实验．如图2(b)和图2(c)(看40页)所示，HDGF家族蛋白的PWWP结构域都与PAR具有强烈的相互作用．为进一步证实这种相互作用，我们表达并纯化了HRP-2的PWWP结构域的截断突变体蛋白，并检测了这些截断体蛋白与PAR的相互作用．如图2(d)和图2(e)(看40页)所示，缺失PWWP结构域的N末端或C末端完全抑制了PWWP结构域和PAR之间的相互作用．这些结果表明，HDGF蛋白家族的PWWP结构域是PAR结合结构域．

图2 PWWP结构域是个PAR结合结构域Fig.2 PWWP domains is a PAR binding module(a) HRP2的PWWP结构域与PAR修饰的PARP1相互作用；(b) HDGF家族的PWWP结构域的SDS-PAGE电泳及考马斯亮蓝染色；(c) Dot blot鉴定PWWP结构域与PAR的体外结合；(d) PWWP结构域及其突变体的SDS-PAGE电泳及考马斯亮蓝染色；(e) Dot blot鉴定PWWP结构域及其突变体与PAR体外结合．

2.3 HRP-2缺失突变细胞对DNA损伤剂敏感

之前的研究表明很多PAR结合蛋白能在DNA损伤时被招募到DNA损伤位点，从而参与DNA损伤应答[4-5,8,11]．我们检测了HRP-2是否能在激光诱导DNA损伤的细胞中被招募到DNA损伤部位．虽然阳性对照CHFR能快速地定位于激光诱导的DNA损伤处，但是在激光处理细胞引起DNA损伤后，GFP-HRP2的定位没有明显变化，表明HRP2在DNA损伤时不能被招募到DNA损伤位点(数据未显示)．

图3 HRP-2表达水平被其 siRNA显著抑制Fig.3 Expression of HRP-2 was inhibited by its siRNA

接着我们检测HRP-2缺失细胞对DNA损伤药物的敏感性．前期的研究中，我们发现HRP-2特异siRNA能显著降低其在肝癌细胞中的表达[29]．因此，我们将HRP-2特异siRNA或对照siRNA分别转入QGY-7703，并用Western blot的方法来检测其表达情况．如图3所示，相对于对照细胞，HRP-2特异siRNA转染的细胞，其HRP-2的表达水平显著降低．

然后我们用DNA损伤药物CPT和MMS处理转染HRP-2特异siRNA或对照siRNA的细胞，并通过CKK8试剂盒来检测细胞的存活率．如图4所示，DNA损伤剂CPT或MMS处理后，相对于对照组细胞，HRP-2缺失细胞的存活率明显降低，表明HRP-2缺失细胞对DNA损伤剂非常敏感，HRP-2可能在DNA损伤修复中具有重要的功能．这并不奇怪，许多蛋白参与DNA损伤修复，但并不定位到DNA损伤位点例如，最近报道的53BP1的相互作用蛋白TIRR尽管在DNA损伤后不能被招募到DNA损伤部位，但是TIRR缺失细胞对DNA损伤剂呈现敏感性[31]．

图4 HRP-2消减细胞对DNA损伤药物敏感Fig.4 HRP-2 depletion cells are sensitive to DNA damage agent(a) HRP-2消减细胞对DNA损伤药物MMS敏感；(b) HRP-2消减细胞对DNA损伤药物CPT敏感．

3 结 论

本研究中，我们通过亲和纯化和质谱分析的方法鉴定了大量与PAR特异结合的蛋白，并在体外进一步验证了所鉴定的CDK9、EWSR1、FXR1和HRP2与PAR的结合．在此基础上，我们还发现HDGF家族成员的PWWP结构域是一个PAR结合结构域；而且HRP-2消减能导致细胞对DNA损伤药物敏感，表明HRP2可能参与了DNA损伤修复过程．这些结果为进一步研究PAR及其相互作用蛋白的功能打下了坚实的基础．

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