产前850-1900MHz手机暴露对子代大鼠齿状回PCNA和DCX表达的影响*

王凌星，黄红红，吕国荣

（1.福建医科大学附属第二医院神经内科，2.福建医科大学附属第二医院B超室，3.泉州医学高等专科学校，泉州362000）

神经发生是指由神经干／前体细胞形成神经元的过程，神经干细胞是具有自我更新和分化能力的不成熟细胞，能够分化成神经元和星形或少突胶质细胞。大脑海马的神经发生会受产前不良环境影响：妊娠早期或晚期的产前应激均会抑制幼年子代恒河猴海马齿状回的神经发生［1］，产前药物、酒精暴露或妊娠期母体睡眠剥夺均会改变青年子代大鼠的海马神经发生［2-4］。上述研究结果表明产前不良环境可能产生持久影响，改变子代出生后，甚至是成年时的海马神经发生。手机被动暴露成为一种重要的产前不良环境。探讨产前手机暴露对子代大鼠海马神经发生的影响，对预测子代脑组织的功能及损伤后修复具有积极意义。增殖细胞核抗原（proliferating cell nuclear antigen，PCNA）是增殖细胞的内源性标志分子［5］，双皮质素（doublecortin，DCX）是海马齿状回神经发生和新生神经元的分子标志物［6］，这两个指标可以体现海马神经细胞的增殖和分化。因此本研究通过检测产前手机暴露后子代大鼠海马齿状回PCNA和DCX表达，从而探讨不同时程产前手机暴露对子代大鼠海马神经发生的影响。

1 材料与方法

1.1 实验材料与设备

兔抗鼠 PCNA多克隆抗体（产品编号 bs-2006R）、兔抗鼠脑源性神经营养因子（brain derived neurotrophic factor，BDNF）多克隆抗体（产品编号bs-4989R）、兔抗鼠β-肌动蛋白多克隆抗体（β-actin，产品编号bs-0061R））、生物素标记的羊抗兔IgG抗体（产品编号bs-0295G-Bio）、生物素标记的兔抗羊IgG抗体（产品编号bs-0294R-Bio）、辣根过氧化酶标记羊抗兔IgG抗体（产品编号bs-0295G-HRP）、辣根过氧化酶标记兔抗羊 IgG抗体（产品编号 bs-0294RHRP）、BCA蛋白浓度测定试剂盒、硝酸纤维素膜、电化学发光（Electro-Chemi-Luminescence，ECL）试剂盒购自北京博奥森生物公司；羊抗鼠DCX多克隆抗体（产品编号sc-8066）购自美国santa cruz公司。

1.2 实验动物与方法

1.2.1 孕鼠手机射频暴露模型 SD大鼠均购自上海斯莱克实验动物有限公司。12周龄雄性及雌性SD大鼠各18只，按1∶1随机合笼，发现阴栓为妊娠第0天。18只孕鼠随机分为3组：分别为短时暴露组、长时暴露组和对照组（n＝6），放于一个饲养笼内。大鼠均可自由获取水及食物，饲养温度为22℃±1℃，光照时间为7：00 am～7：00 pm。参照文献方法进行孕鼠手机射频暴露［7］：每个实验笼装有一个无声的800～1 900 Mhz三星手机（SM-G3608，GSM网络，850～1 900MHz），其比吸收率（Specific Absorption Ratio，SAR）为 1.6 W／kg，放置在饲养瓶区域，并于笼内放置电磁辐射监测仪（Anritsu MS2711，Japan）测定手机辐射量，实验过程中的磁场强度为通话状态5～18微特斯拉，待机状态2～6微特斯拉。短时暴露组、长时暴露组和对照组大鼠分别置于不同房间。从妊娠第1天至第17天，短时暴露组的手机处于每天 6 h通话状态（8：00～12：00，14：00～16：00），长时暴露组的手机处于每天24 h通话状态（为避免手机发热对实验的影响，由两部手机交替进行），对照组手机处于未使用状态。为确保独立于妊娠期可变化长短（18～20 d）的平等暴露时间，在第17天结束，所有的手机被移除。在第18天，孕鼠被分开放置在单独的笼内待产。孕鼠均自然分娩，记录各组孕鼠的妊娠期长短、妊娠期体重增长（发现阴栓至妊娠第18天）、各仔鼠的出生体重，随后每窝仔鼠随机留6只饲养以避免奶水摄入不足对子代大鼠生长的影响。子代大鼠满3周后断乳。

1.2.2 取材 子代大鼠于1月龄时，每组随机选取子代大鼠6只（每窝1只），于10%水合氯醛腹腔注射麻醉后，4%多聚甲醛心脏灌注后取脑。冠状位切取包含海马部分的脑组织块（脑图谱上前囱往后约1.5～5 mm处），石蜡包埋，5μm切片。焦油紫染色：切片进行二甲苯脱蜡、梯度酒精水化、焦油紫染色、酒精分化及脱水、二甲苯透明后中性树脂封片。光镜下观察海马齿状回细胞的变化。

PCNA和DCX免疫组化：切片经二甲苯脱蜡后梯度酒精水化，抗原修复后加入3%H2O2灭活内源性酶，分别与兔抗鼠 PCNA一抗（1∶400）和羊抗鼠DCX一抗（1∶200）孵育，PBS冲洗后与生物素化二抗孵育，DAB显色，中性树脂封片。高倍显微镜下观察齿状回内PCNA和DCX的表达情况，并使用Image Pro-plus 6.0图像分析系统计数齿状回颗粒细胞下层PCNA阳性细胞数。

1.2.3 Western blot检测 子代大鼠于1月龄时，每组随机选取子代大鼠6只（每窝1只），于麻醉后快速断头取脑，分离海马组织，液氮冻存。提取海马组织总蛋白，BCA法进行蛋白定量，10%聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS-PAGE）分离等量组织蛋白后转印到硝酸纤维素膜。5%脱脂奶粉室温封闭后分别加入羊抗鼠 DCX一抗（1∶400）、BDNF一抗（1∶400）、βactin（1∶2 000），4℃过夜并于洗涤后与辣根过氧化酶标记二抗孵育。ECL显影后采用image j软件系统分析各条带吸光度值，并以目的条带与β-actin的吸光度比值表示最终结果。

1.3 统计学处理

采用SPSS13.0统计软件进行数据分析，计量资料以均数±标准差（±s）表示，采用单因素方差分析（ANOVA），两两比较采用SNK检验。

2 结果

2.1 产前手机暴露对孕鼠及子代大鼠生理指标的影响

对照组、短时暴露组、长时暴露组大鼠的孕期、妊娠期体重增长和各组的胎儿数、胎儿出生体重无显著差异（P＜0.05，表 1）。

Tab.1 Length of pregnancy，maternal weight gain，litter size and pup’s body weight in three groups（±s，n＝6）

Tab.1 Length of pregnancy，maternal weight gain，litter size and pup’s body weight in three groups（±s，n＝6）

Group Length of pregnancy（days）Maternal weight gain（g） Litter size Pup’s body weight（g ）Control 21.00±0.82 118.73±3.53 9.25±1.26 6.44±0.21 Short term exposure 21.75±0.50 121.06±2.69 9.75±1.20 6.48±0.34 Long term exposure 21.00±0.81 119.41±2.46 8.75±1.25 6.49±0.26

2.2 产前手机暴露对子代大鼠海马齿状回细胞形态的影响

焦油紫染色低倍镜下可见呈“V”形的齿状回与呈“C”形的海马相互嵌合，齿状回主要由染色相对较深的颗粒细胞层组成，颗粒细胞层围住的细胞区域为多形细胞层，此层细胞成分较少（图1A-C）。高倍镜下，对照组（图1D）、短时暴露（图1E）和长时暴露组（图1F）的齿状回颗粒细胞层均可见紧密排列的颗粒细胞，细胞呈圆形，细胞核呈特征性的泡状，各组颗粒细胞的大小及形态没有明显差异。对照组及短时暴露组的多形细胞层均可观察到散在的锥形细胞，具有泡状核且细胞体呈三角形（图1D和E），而长时暴露组的多形细胞层可见较多被空泡区域包绕的锥形细胞，部分核皱缩且深染（图1F，图1见彩图页Ⅰ）。

Fig. 1 Representative photomicrographs of dentate gyrus in rat offspring of control group（A and D），short term maternal mobile phone exposure group（B and E）and long term maternal mobile phone exposure group（C and F）by Cresyl violet staining

2.3 产前手机暴露对子代大鼠海马齿状回PCNA和DCX表达的影响

海马齿状回PCNA阳性细胞呈棕红色，主要分布在颗粒细胞下层（图2A-F）。短时暴露组（图2B、图2E）齿状回颗粒细胞下层PCNA阳性细胞与对照组（图2A、图2D）比较差异无统计学意义，而长时暴露组（图2C和F）较对照组、短时暴露组明显减少，差异有统计学意义（P＜0.05，表2）。低倍镜下，对照组（图2G）和短时暴露组（图2H）可见大量的DCX阳性细胞沿着齿状回颗粒细胞下层分布，形成明显的棕色“V”形，而在长时暴露组（图 2I），DCX阳性细胞明显减少，所形成的棕色“V”形淡且模糊。高倍镜下，可见对照组（图2J）和短时暴露组（图2K）的DCX阳性细胞的胞体位于齿状回颗粒细胞下层，部份胞位簇状排列，突起长并向颗粒细胞层延伸，部份甚至到达分子层，而在长时暴露组（图2L，图2见彩图页×），DCX阳性细胞的胞体同样位于齿状回颗粒细胞下层，但胞体排列稀疏，突起少而短。对各组海马DCX表达进行Western blot检测（图3），DCX相对表达量短时暴露组与对照组比较差异无统计学意义，而长时暴露组的DCX表达量较对照组、短时暴露组明显减少，差异有统计学意义（P＜0.05，表2，图2，见彩图页Ⅰ）。

Fig. 2 Immunohistochemical expression of PCNA and DCX in dentate gyrus of rat offspring in control group（A, D, G and J）, short term maternal mobile phone exposure group（B, E, H and K）and long term maternal mobile phone exposure group（C, F, I and L）

2.4 产前手机暴露对子代大鼠海马BDNF表达的影响

各组海马均可检测到BDNF表达（图3），长时暴露组的BDNF表达较对照组、短时暴露组明显减少，差异有统计学意义（P＜0.05，表2）。短时暴露组BDNF表达虽较对照组增加，但差异无统计学意义。

Tab.2 PCNA positive cells and the expression of DCX and BDNF in the three groups（±s，n＝6）

Tab.2 PCNA positive cells and the expression of DCX and BDNF in the three groups（±s，n＝6）

PCNA：Proliferating cell nuclear antigen；DCX：Doublecortin；BDNF：Brain derived neurotrophic factor*P＜0.05 vs control group；#P＜0.05 vs short term exposure group

Group PCNA DCX BDNF Control 20.00±0.82 0.71±0.02 0.57±0.04 Short term exposure 21.50±1.00 0.68±0.03 0.60±0.01 Long termexposure 10.75±1.26*#0.39±0.02*#0.38±0.02*#

Fig.3 Expression of DCX and BDNF in hippocampus of rat offspring by Western blot

3 讨论

本研究结果表明，不同强度产前手机暴露并不影响孕鼠妊娠期体重增长，从而排除了产前手机暴露对孕鼠营养的影响。此外，产前手机暴露并不影响孕期长短、胎鼠数量和胎鼠的出生体重，这与既往的研究结果一致［8］。

海马齿状回是神经发生的重要场所，产前手机暴露对子代大鼠齿状回细胞形态的影响目前尚不明确。不同研究的结论不尽相同，有研究表明妊娠期手机暴露会引起子代大鼠海马齿状回颗粒细胞的形态和数目出现改变［8］，而另有研究则认为妊娠期手机暴露并不改变子代大鼠海马齿状回的细胞形态［10］。这些不同的结果可能与手机产前暴露的强度有关。本研究中设计了短时和长时产前手机暴露，均未发现子代大鼠齿状回颗粒细胞大小和形态的改变，但在长时暴露组，多形细胞层的细胞形态出现了改变。这说明长时间的产前手机暴露会引起子代大鼠齿状回细胞形态改变。虽然在本研究中，这种细胞形态改变只出现在多形细胞层，但作为神经干细胞主要分布区的颗粒细胞下层位于颗粒细胞层和多形细胞层之间，与多形细胞层紧密相邻。推测多形细胞层的这种形态学改变可能会引起颗粒细胞下层的神经干细胞功能改变，影响海马齿状回神经发生。

增殖是神经发生的初始阶段。PCNA是DNA聚合酶δ的辅助蛋白，与DNA复制相关，在细胞周期的所有时相表达，因此PCNA可作为增殖细胞的内源性标志分子［5］。本研究对照组和暴露组均在海马齿状回颗粒细胞下层发现PCNA阳性细胞，提示存在细胞增殖，但长时暴露组PCNA阳性细胞较对照组和短时暴露组明显减少，提示产前长时程手机暴露抑制了子代大鼠海马齿状回颗粒细胞下层的细胞增殖，而产前短时手机暴露则对该区域细胞增殖无影响。此外还发现产前长时手机暴露引起子代大鼠齿状回颗粒细胞下层DCX阳性细胞数量减少以及细胞突起改变。DCX表达被认为是海马齿状回神经发生的分子标志物且只表达于新生神经元［6］，DCX表达的减少提示齿状回神经干细胞向新生神经元的分化受到抑制。不仅如此，DCX阳性细胞突起的改变还会影响新分化的神经元与其他神经细胞建立突触联系，从而影响神经网络的构成。因此，产前手机暴露会抑制子代大鼠海马齿状回的细胞增殖和神经元分化，且与产前手机暴露的程度相关。

BDNF是一种神经营养因子，BDNF可通过与酪氨酸激酶 B受体（tyrosine receptor kinase B，TrkB）结合，启动下游信号通路，如磷脂酰肌醇3激酶（phosphatidylinositol 3 kinase，PI3K）／蛋白激酶 B（protein kinase B，PKB）［11］和细胞外信号调节激酶（extracellular signal-regulated kinase，ERK），促进神经干／前体细胞的增殖和分化，在神经元的生长、分化、成熟过程中发挥重要作用［12］。已有研究表明BDNF可以在体外诱导人类骨髓间充质细胞分化为神经元样细胞［13］，且敲除小鼠的BDNF基因会损害齿状核颗粒细胞下层新生神经元的分化和成熟，局部合成BDNF则促进了神经前体细胞的分化和成熟［14］。此外，有研究发现宫内感染可以通过影响BDNF及下游信号通路而改变子代大鼠的内源性海马神经发生［11］，这说明产前不良环境可以产生持久的影响，改变出生后子代大鼠的BDNF而影响神经发生。本实验中产前长时手机暴露组子代大鼠海马BDNF表达较对照组和短时暴露组减少，推测产前长时手机暴露可能通过改变子代大鼠海马BDNF表达而影响齿状回的神经细胞增殖和神经元分化。但是，这一过程的具体机制尚不明确，产前手机暴露是否会改变母体的下丘脑-垂体轴，进而间接影响子代大鼠脑部发育，或是直接通过影响子代大鼠海马BDNF而改变下游PI3K／PKB信号通路，最终影响神经发生，这些都有待于今后的进一步研究。

总之，本研究表明产前长时手机暴露会改变子代大鼠海马齿状回的形态、细胞增殖和神经元分化，而产前短时手机暴露则不会造成影响。

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