内质网过度应激在肺缺血／再灌注小鼠心肌损伤中的作用*

项冰倩，高 慧，郝卯林，戴雍月，王万铁

（温州医科大学缺血／再灌注损伤研究所，浙江温州325035）

肺缺血 ／再灌注损伤（ischemia／reperfusion injury，I／RI）是肺溶栓治疗、肺移植、肺切除等手术常见的病理过程。肺缺血／再灌注引发急性肺损伤的同时还可诱发远隔器官损伤，如脑、心脏、肝及肾脏等。心脏血流量和耗氧量大，对缺血缺氧较为敏感，是较易受累的器官。肺缺血再灌注引起的缺血、缺氧可诱发内质网应激（endoplasmic reticulum stress，ERS），内质网应激是指当机体发生缺血、缺氧，氧化应激，葡萄糖／营养物质匮乏，异常糖基化反应和钙离子稳态失衡等时，内质网未折叠蛋白明显增多，当超出内质网处理能力时，细胞会激活未折叠蛋白反应、内质网超负荷反应和Caspase 12介导的凋亡通路等信号途径，来应对条件的变化和恢复内质网良好的蛋白质折叠环境。适度的ERS可恢复细胞内环境稳态和维持细胞存活，但持续过强的ERS则会导致细胞凋亡甚至死亡，在缺血／再灌注损伤中起重要作用［1-3］。前期的研究结果表明，过度内质网应激参与了肺缺血／再灌注损伤，且抑制内质网应激能减轻肺I／R损伤［1，4］，但其是否参与了肺 I／R诱发的心肌损伤目前尚未见有关报道。因此本研究在肺缺血／再灌注模型上通过使用ERS激动剂衣霉素及抑制剂4-苯丁酸来探讨内质网应激在肺缺血再灌注小鼠心肌损伤中的作用，为临床防治肺I／R引起的远隔器官损伤提供科学依据。

1 材料与方法

1.1 试剂与仪器

1.1.1 主要试剂 二甲基亚砜（dimathy sulfoxide，DMSO）（上海申工生物技术有限公司）；衣霉素（tunicamycin，TM）和 4-苯丁酸（4-phenylbutyric acid，PBA）（Sigma公司）；氯胺酮和塞拉嗪（中国福建古田药业有限公司）；Caspase 3酶活性检测试剂盒和BCA蛋白定量试剂盒（碧云天生物技术研究所）；TUNEL试剂盒（瑞士 Roche公司）；肌酸激酶同工酶（creatine kinase-MB，CK-MB）及乳酸脱氢酶（lactic dehydrogenase，LDH）试剂盒（南京建成生物工程研究所）；逆转录试剂盒（Thermo公司）；葡萄糖调节蛋白78（glucose regulated protein 78，GRP78），c-Jun氨基末端激酶（c-JunN-terminalkinase，JNK），p-Jun氨基末端激酶（p-JunN-terminalkinase，p-JNK），天冬氨酸特异性半胱氨酸蛋白酶-12（cysteinylaspartate specific proteinase 12，Caspase 12）和 CCAAT增强子结合蛋白同源蛋白（CCAAT／enhancer-binding protein homologous protein，CHOP）一抗（Cell Signaling Technology公司，美国）；辣根酶标记山羊抗兔二抗（中国博蕴）；一抗稀释液（碧云天生物技术研究所）；PVDF膜（德国 Millipore公司）；胎牛血清（美国 Gibco公司）；脱脂奶粉（美国BD公司）。

1.1.2 主要仪器 UV-800全自动凝胶成像分析系统（温州奥利生物医学仪器厂）；光学显微镜（Nikon，日本尼康）；高速冷冻离心机（Thermo，美国）；全自动生化分析仪（7600-020，日本日立公司产品）；紫外分光光度计（Ultrospec 2100pro Amersham BioSciences，美国）；PCR热循环仪（LifePro，杭州博日科技有限公司）；多功能酶标仪（Thermo，美国）；蛋白电泳／转膜仪（BIO-RAD，美国）；电热恒温水温箱（上海贺德试验设备厂）；DYY-5型稳压稳流电泳仪（北京市六一仪器厂）。

1.2 动物模型与干预

1.2.1 实验动物与模型建立 雄性健康 SPF级C57BL／6J小鼠40只，体质量 20～24 g，8～10周龄，由温州医科大学实验动物中心提供【SYXK（浙）2012-075】。依据文献采用C57BL／6J小鼠在体左侧肺门夹闭制备缺血／再灌注（I／R）模型［5］。腹腔注射 100 mg／kg氯胺酮和塞拉嗪 10 mg／kg麻醉，维持体温36.5℃～37.5℃。消毒胸颈部皮肤后切开并分离皮下组织和肌肉，暴露气管T型切开，气管插管后接呼吸机行机械通气，呼吸机参数为：吸呼比2∶3，呼吸频率 120 counts／min，100%氧浓度，潮气量 0.6～0.8 ml／min。于左胸部3～5肋间处开胸并游离左侧肺门，用动脉夹阻断左肺门，30 min后松开动脉夹再灌注180 min制备肺缺血再灌注模型。Sham组仅行开胸处理，不夹闭肺门，机械通气210 min；TM组、4-PBA组分别于造模前30 min腹腔注射衣霉素1 mg／kg和 4-苯基丁酸 400 mg／kg，再制备肺缺血／再灌注模型。

1.2.2 动物分组与干预 采用随机数字表法，将其分为 4组（n＝10）：假手术组（Sham组）、缺血／再灌注组（I／R组）、ERS通路激动剂衣霉素（Tunicamycin，TM）组，ERS通路抑制剂4-PBA组。TM组、4-PBA组分别于造模前30 min腹腔注射衣霉素1 mg／kg和4-PBA 400 mg／kg，再制备肺缺血／再灌注模型。

1.3 检测方法

1.3.1 光镜下心肌组织形态学观察 开胸取出心肌组织后，取约0.5 cm×0.5 cm×0.5 cm大小心肌组织，经4%甲醛固定，常规进行石蜡包埋切片，HE染色后光镜下观察各组标本组织学改变。

1.3.2 心肌酶检测 再灌注180 min时，眼眶取血，于-80℃冰箱保存。按照CK-MB及 LDH试剂盒操作说明书用全自动生化分析仪检测血清CK-MB及LDH的浓度。

1.3.3 TUNEL法检测心肌细胞凋亡指数 石蜡包埋心肌组织并切片，依次经染色、二甲苯、无水乙醇、95%和75%乙醇、PBS漂洗后加入蛋白酶K溶液去除组织蛋白，蒸馏水漂洗后按照TUNEL试剂盒操作说明书进行操作，光学显微镜（×400）下观察心肌细胞凋亡情况。细胞核呈现棕黄色者为阳性细胞，即凋亡细胞。每张切片400倍光镜下随机选择10个视野并记录总细胞数和阳性凋亡细胞数，计算凋亡指数（apoptosis index，AI），AI＝（凋亡细胞数／总细胞数）×100%。

1.3.4 Caspase 3酶活性检测 按每3～10 mg心肌组织加入100μl裂解液的比例加入裂解液，冰上研磨成匀浆，转移到1.5 ml离心管中冰中裂解5 min。4℃，20 000 r／min离心 10～15 min后转移上清液，按照Caspase 3活性检测试剂盒操作说明书进行操作，采用分光光度计法检测心肌组织中Caspase 3酶活性。

1.3.4 Western blot分析 取心肌组织，低温下充分研磨，400μl RIPA（含 4μl PMSF）裂解组织，混匀后取匀浆液4℃离心取上清，BCA蛋白定量试剂盒测定蛋白浓度并绘制标准曲线。将蛋白样品制成2 μg／μl，煮沸 10 min变性。凝胶电泳，上样量 20μl，湿转至PVDF膜，5%脱脂奶粉室温封闭2 h，TBST漂洗，JNK、GRP78、CHOP一抗（1∶1 000）、GAPDH、Caspase12一抗（1∶800），4℃孵育过夜。TBST洗涤 3次，每次7 min，加入二抗室温孵育1 h。TBST洗涤3次，每次5 min，加ECL工作液反应2 min，暗室曝光，显影、定影后，凝胶分析软件分析蛋白吸光度值。p-JNK条带灰度值和JNK条带灰度值之比表示p-JNK蛋白相对含量，Caspase 12、CHOP、GRP78条带灰度值和内参GAPDH灰度值之比表示Caspase 12、CHOP、GRP78蛋白相对含量。

1.3.4 RT-PCR分析 取心肌组织加液氮研磨，Trizol法提取总RNA，测定RNA浓度，按照RT-PCR试剂盒说明书进行cDNA合成及扩增。PCR参数，预变性：94℃，3 min；变性：94℃，30 s；退火：JNK（56℃），Caspase 12（58℃），CHOP（54℃），GRP78（49℃），GAPDH（58℃），30 s；延伸：72℃，1 min；终止延伸：72℃，5 min；循环33次。RT-PCR以GAPDH为内参。引物序列见表1。结果用Quantity One分析。JNK、Caspase 12、CHOP、GRP78 mRNA条带灰度值和内参GAPDH条带灰度值的比值表示 JNK、Caspase 12、CHOP、GRP78 mRNA相对含量。

1.4 统计学方法

采用SPSS19.0软件进行分析，正态分布的计量资料以均数±标准差（±s）表示，组间比较采用单因素方差分析。

Tab.1Sequences of the primers

2 结果

2.1 小鼠肺缺血／再灌注损伤后光镜下心肌组织形态学观察

光学显微镜结果显示：Sham组心肌组织结构和细胞层次清晰可见，细胞排列整齐紧密，形态正常。I／R组心肌细胞间隙和细胞体积稍增大，胞质疏松、淡染，水肿较明显。TM组细胞明显水肿，伴有部分细胞坏死。4-PBA组细胞排列尚规则，体积稍大，呈轻度水肿改变（图1）。

Fig.1 Morphologic changes of heart tissue in each group（HE×200）

2.2 小鼠肺缺血／再灌注损伤后血清 CK-MB和LDH活性观察

与Sham组相比，其余3组CK-MB和LDH活性均明显升高（P＜0.01）；与 I／R组相比，TM组 CKMB和LDH活性明显升高（P＜0.01），4-PBA组则明显下降（P＜0.01）；与 TM组相比，4-PBA组明显下降（P＜0.01，表 2）。

Tab.2 The change of CK-MB and LDH（U／L，±s，n＝10）

Tab.2 The change of CK-MB and LDH（U／L，±s，n＝10）

Sham：Sham group；I／R：Ischemia／reperfusion injury group；TM：Tunicamycin group；4-PBA：4-phenylbutyric acid group；CKMB：Creatine kinase-MB；LDH：Lactic dehydrogenase**P＜0.01 vs sham group；##P＜0.01 vs I／R group；△△P＜0.01 vs TM group

group CK-MB LDH Sham 526.16±30.70 1540.91±51.07 I／R 1511.02±57.44** 6252.77±63.72**TM 2254.69±66.18**##6953.00±79.87**##4-PBA 925.15±69.83**##△△ 5335.47±71.40**##△△

2.3 小鼠肺缺血／再灌注损伤后心肌细胞凋亡指数观察

TUNEL染色结果显示：与Sham组相比，其余3组细胞凋亡指数均明显升高（P＜0.01）；与 I／R组相比，TM组细胞凋亡指数明显升高（P＜0.01），4-PBA组则明显下降（P＜0.01）；与 TM组相比，4-PBA组细胞凋亡指数明显下降（P＜0.01，表 3，图 2）。

Fig.2 Cell apoptosis index of heart tissue in each group（TUNEL×200）

2.4 小鼠肺缺血／再灌注损伤后心脏组织中Caspase 3酶活性观察

Caspase 3酶活性结果显示，与Sham组相比，其余3组Caspase 3酶活性均明显升高（P＜0.01）；与I／R组相比，TM组Caspase 3酶活性明显升高（P＜0.01），4-PBA组则明显下降（P＜0.01）；与 TM组相比，4-PBA组明显下降（P＜0.01，表 3）。

Tab.3 Change of cell apoptosis index and Caspase 3 enzymatic activity（±s，n＝10）

Tab.3 Change of cell apoptosis index and Caspase 3 enzymatic activity（±s，n＝10）

Sham：Sham group；I／R：Ischemia／reperfusion injury group；TM：Tunicamycin group；4-PBA：4-phenylbutyric acid group**P＜0.01 vs sham group；##P＜0.01 vs I／R group；△△P＜0.01 vs TM group

Caspase 3 Sham 13.05±3.40 37.74±7.16 I／R 75.85±4.49** 127.74±8.72**TM 86.63±4.24**## 220.61±14.69**##4-PBA 60.18±4.14**##△△ 83.58±8.10**##Group Apoptosis index（%）△△

2.5 小鼠肺缺血／再灌注损伤后心肌组织 JNK、Caspase 12、CHOP、GRP78 mRNA表达水平的变化

与Sham组相比，其余 3组 JNK、Caspase 12、CHOP和GRP78 mRNA表达水平均明显升高（P＜0.01）；与 I／R组相比，TM组 JNK、Caspase 12、CHOP和GRP78 mRNA表达水平明显升高（P＜0.01），4-PBA组则明显下降（P＜0.01）；与 TM组相比，4-PBA组mRNA表达水平明显下降（P＜0.01，表4）。

2.6 小鼠肺缺血／再灌注损伤后心肌组织p-JNK、Caspase 12、CHOP、GRP78蛋白表达水平的变化

与Sham组相比，其余 3组 p-JNK、Caspase 12、CHOP和GRP78蛋白表达水平均明显升高（P＜0.01）；与 I／R组相比，TM组 p-JNK、Caspase12、CHOP和GRP78蛋白表达水平明显升高（P＜0.01），4-PBA组则明显下降（P＜0.01）；与 TM组相比，4-PBA组蛋白表达水平明显下降（P＜0.01，表5）。

3 讨论

I／R是临床常见的病理过程，器官 I／R时细胞内信号转导涉及多条途径，其中ERS和JNK信号转导通路在脏器I／R中起重要作用［1］。内质网应激发生时，ERS既能诱导GRP78、GRP94等内质网分子伴侣表达而产生保护效应，亦能独立地诱导细胞凋亡。

Tab.4 Expression levels of JNK，Caspase 12，CHOP and GRP78 mRNA in each group（±s，n＝10）

Tab.4 Expression levels of JNK，Caspase 12，CHOP and GRP78 mRNA in each group（±s，n＝10）

Sham：Sham group；I／R：Ischemia／reperfusion injury group；TM：Tunicamycin group；4-PBA：4-phenylbutyric acid group；JNK：c-JunN-terminalkinase；Caspase 12：Cysteinylaspartate specific proteinase-12；CHOP：CCAAT／enhancer-binding protein homologous protein；GRP78：Glucose regulated protein 78**P＜0.01 vs Sham group；##P＜0.01 vs I／R group；△△P＜0.01 vs TM group

Group JNK Caspase 12 CHOP GRP78 Sham 0.14±0.04 0.15±0.05 0.16±0.05 0.14±0.05 I／R 0.48±0.06** 0.55±0.03** 0.57±0.06** 0.45±0.06**TM 0.59±0.07**## 0.69±0.06**## 0.69±0.02**## 0.58±0.06**##4-PBA 0.39±0.02**##△△ 0.44±0.07**##△△ 0.45±0.07**##△△ 0.34±0.03**##△△

Tab.5 Expression levels of p-JNK，Caspase 12，CHOP and GRP78 protein in each group（±s，n＝10）

Tab.5 Expression levels of p-JNK，Caspase 12，CHOP and GRP78 protein in each group（±s，n＝10）

Sham：Sham group；I／R：Ischemia／reperfusion injury group；TM：Tunicamycin group；4-PBA：4-phenylbutyric acid group；JNK：c-JunN-terminalkinase；Caspase 12：Cysteinylaspartate specific proteinase 12；CHOP：CCAAT／enhancer-binding protein homologous protein；GRP78：Glucose-regulated protein 78**P＜0.01 vs Sham group；##P＜0.01 vs I／R group；△△P＜0.01 vs TM group

Group p-JNK Caspase 12 CHOP GRP78 Sham 0.18±0.03 0.26±0.07 0.23±0.05 0.27±0.06 I／R 0.77±0.06** 0.74±0.04** 0.77±0.03** 0.61±0.02**TM 0.89±0.08**## 0.83±0.03**## 0.86±0.07**## 0.72±0.05**##4-PBA 0.64±0.05**##△△ 0.60±0.08**##△△ 0.67±0.04**##△△ 0.48±0.08**##△△

ERS通路激动剂衣霉素是N-乙酰葡糖胺磷酸转移酶的抑制剂，可抑制N-蛋白质糖基化作用的第一步催化反应，引起蛋白质糖基化障碍，诱导未折叠蛋白积聚，导致体内外发生广泛的内质网应激反应［6-8］。是目前体外用于诱导内质网应激较经典的药物［9，10］。ERS抑制剂 PBA是一种化学性分子伴侣，可通过抑制内质网应激减轻非折叠蛋白反应并进一步减轻组织损伤。

本实验中GRP78的急速上调被认为是ERS最敏感的标志物［11，12］。JNK信号通路是 ERS的凋亡途径之一。有研究表明，在脏器I／R损伤过程中，JNK发生过度激活，而在缺血或再灌注前抑制JNK激活可明显减少细胞凋亡，减轻脏器 I／R损伤［13-15］。Caspase 12广泛存在于小鼠的各组织中，是ERS的主要凋亡信号分子之一，内质网内钙离子平衡的失调或者内质网蛋白积累过多都会导致Caspase 12的表达。过度的ERS可引起其他Caspase家族如Caspase 9和Caspase 3的活化，引起一系列的级联反应，最终导致细胞凋亡的发生［16，17］。CHOP是促凋亡的重要信号分子，是ERS特异的转录因子，在正常情况下表达水平很低，而在ERS时，其表达量大大增加，被认为是内质网应激的标志物［18］。细胞凋亡是程序性细胞死亡（programmed cell death，PCD），可被多种细胞信号激活，主要信号通路有线粒体途径与死亡受体途径。细胞内的凋亡信号通常激活线粒体途径，释放线粒体促凋亡蛋白及凋亡诱导因子（apoptosis inducing factor，AIF）等，激活 Caspase级联反应，诱发细胞凋亡。

本实验光镜结果说明肺缺血／再灌注引发了内质网应激并造成心肌损伤，而ERS通路抑制剂4-PBA能明显降低心肌组织损伤性因子的表达，减轻心肌组织学损伤性结构的改变，对心肌组织起到了有效的保护作用，其机制可能与抑制内质网应激通路有关。邹麓等［19］研究表明大鼠离体心肌细胞的损伤与ERS相关的凋亡密切相关，缺血后处理能减轻大鼠离体心脏缺血／再灌注损伤，可能与抑制PERK通路介导的ERS相关凋亡相关。除此之外，梁向艳等人的研究［20］亦表明血管钠肽可减轻糖尿病大鼠缺血／再灌注心脏损伤，可能是通过cGMPPKG信号通路抑制内质网应激及细胞凋亡促进心脏功能恢复。

综上所述，过度内质网应激参与肺缺血／再灌注心肌损伤，抑制内质网应激能减轻心肌组织损伤。

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