紫参薯查尔酮合成酶及异构酶基因的克隆与表达分析

赵景梅　黄东益　张青　许云

摘 要 查尔酮合成酶及其异构酶是黄酮类化合物合成途径中的2个关键酶，为研究其在紫参薯花青素合成途径中的功能，利用RT-PCR技术从紫参薯Da56块茎中克隆到查尔酮合成酶（chalcone synthase，CHS）和查尔酮异构酶（chalcone isomerase，CHI）基因，分别命名为DaCHS和DaCHI。结果表明：DaCHS基因包含825 bp的完整开放阅读框（ORF），预测编码274个氨基酸；DaCHI基因包含663 bp的完整开放阅读框，预测编码221个氨基酸。生物信息学分析结果表明，紫参薯DaCHS与油棕EgCHS亲缘关系最近，氨基酸相似性达到90%；紫参薯DaCHI与野茶树CaCHI亲缘关系最近，氨基酸相似性达到67%。实时荧光定量PCR检测结果表明，DaCHS和DaCHI基因均具有组织表达特异性，其中DaCHS在花中相对表达量最高，而DaCHI在块茎中相对表达量最高；在紫参薯块茎发育不同时期的表达分析表明，DaCHS、DaCHI均在薯块膨大期相对表达量最高。本研究通过对DaCHS和DaCHI基因全长cDNA序列的克隆与分析，为紫参薯花青素合成途径的遗传调控及花青素形成機理的研究奠定基础。

关键词 花青素；查尔酮合成酶；查尔酮合成异构酶；基因克隆；表达分析

中图分类号 S539 文献标识码 A

Abstract Chalcone synthase （CHS） and Chalcone isomerase （CHI） play an important role in the process of flavonoids synthesis. To investigate the function of the DaCHS and DaCHI gene in anthocyanin biosynthesis pathway of Dioscorea alata. L.， the complete genes of chalcone synthase（CHS） and chalcone isomerase（CHI） were isolated from the turber of D. alata. by reverse transcription-polymerase chain reaction （ RT-PCR） named as DaCHS and DaCHI. Sequencing results showed that the cDNA sequence of DaCHS gene contained an open reading frame （ORF） of 825 bp encoding a protenin of 274 amino acids， DaCHI gene contained an open reading frame （ORF） of 663 bp encoding a protenin of 221 amino acids. Phylogeneticanalyses showed that DaCHS and DaCHI had high identity to CHS and CHI protein of many plants. The highly similarity of DaCHS protenin was EgCHS protenin with 90% amino identity. The highly similarity of DaCHS protenin was CaCHI protenin with 67% amino identity. Quantitative real-time PCR analysis showed that the DaCHS and DaCHI expression had tissue specificity. The relative expression level of flowers were the highest in DaCHS. In DaCHI， the tubers had the hightest relative expression level. That expression analysis in different development periods of D. alata. tuber， DaCHS and DaCHI all had the hightest relative expression in expansion period of tubers.The cloning and analysis of full-length cDNA sequences of DaCHS and DaCHI genes should lay a foundation for the genetic regulation of anthocyanin biosynthesis pathway and the mechanism of anthocyanin formation.

Key words anthocyanin； chalcone synthase； chalcone isomerase； gene cloning； expression analysis

doi 10.3969/j.issn.1000-2561.2018.05.014

紫参薯（Dioscorea alata L.）又名紫大薯、脚板薯，属于薯蓣科（Dioscoreaceae）薯蓣属（Dioscorea），是一年生或多年生草质缠绕藤本植物，也是一种常见的块茎类粮食作物，占世界块茎类粮食作物产量的6%[1]，与其它块茎类作物相比，紫参薯在营养上更具优势，不仅含有淀粉、蛋白质、脂类物质，还含有花青素、维生素和矿物质[2]。紫参薯因其块茎中含有大量花青素，可降血脂、抗氧化、降血压，具有很好的药用价值[3]，在中国已被作为传统的保健食品[4]。

查尔酮合成酶及其异构酶一同构成类黄酮合成途径的限速酶[5]。CHS是类黄酮生物合成过程中第一个关键酶，自1983年第1个序列发表后[6]，已从多种植物中克隆到了CHS基因。Vander等[7]利用反义RNA技术抑制矮牵牛CHS基因，导致花青素的合成途径受阻，矮牵牛花色由紫色变成白色。CHI是黄酮类化合物代谢途径中的关键酶，含量降低可导致查尔酮大量积累，同时黄酮类化合物含量减少[8]。Bednar等[9]研究发现在牵牛花中CHI基因表达量的减少，导致黄酮类化合物减少，从而使花呈现绿色。

查尔酮合成酶催化4-香豆酰-CoA（4-coumaricacyl-CoA）与丙二酰-CoA （malonyl-CoA）缩合形成柚苷配基查尔酮，为黄酮类物质提供基本的碳架结构，也为花青素糖苷合成提供保证[10]。查尔酮异构酶可催化查尔酮合成柚皮素[11]，即底物先由查尔酮合成酶催化，再通过查尔酮合成异构酶异构成不同的化合物。目前对紫参薯的研究主要集中在营养成分分析[12]、栽培[13]、花青素提取工艺[14]、稳定性与氧化性[15]及药理作用的研究[16]等方面，对紫參薯花青素合成的基因表达调控鲜见报道。本研究通过对紫参薯DaCHS和DaCHI基因的克隆与生物信息学分析，并对DaCHS和DaCHI基因在紫参薯不同组织中及块茎发育的不同时期进行实时荧光定量研究，为紫参薯花青素合成途径的遗传调控及花青素形成机理的研究奠定基础。

1 材料与方法

1.1 材料

紫参薯Da56种植于海南大学儋州校区薯蓣种质资源圃。克隆载体pMD18-T Vector购于Takara公司；大肠杆菌DH5α由中国热带农业科学院橡胶研究所胶乳代谢课题组提供。TransTaqTE DNA Polymerase High Fidelity （HiFi）购自北京全式金生物技术有限公司；RNA提取试剂盒购自北京百泰克生物技术有限公司；LA Taq、SYBR@Premix Ex TaqTM（Perfect Real Time）和PrimerScriptTM RT Reagent Kit With gDNAEraser（Perfect Real Time）购自Takara Bio Company；Plasmid Mini Kit I（200 Preps）购自Omega Bio-Tek公司；PCR引物合成及测序由南京金斯瑞生物科技公司完成。

1.2 方法

1.2.1 总RNA的提取及cDNA第一链的合成 紫参薯不同组织和块茎发育不同时期的RNA提取参照北京百泰克通用植物总RNA提取试剂盒操作手册进行。反转录参照Takara公司反转录试剂盒进行cDNA第一链的合成。

1.2.2 紫参薯DaCHS和DaCHI基因的扩增 基于紫参薯Da56转录组数据库，利用Primer5.0软件设计CHS和CHI基因的上下游引物（表1）。以紫参薯块茎的cDNA为模板进行扩增。PCR反应程序为：95 ℃ 3 min；95 ℃ 30 s，58 ℃ 30 s，72 ℃ 90 s，35个循环；72 ℃ 10 min。PCR产物经1.2%琼脂糖凝胶电泳检测后，回收目的片段与pMD18-T载体连接后转化大肠杆菌DH5α，挑取阳性克隆送公司测序。

1.2.3 紫参薯DaCHS 和DaCHI 基因的生物信息学分析 下载其他植物CHS、CHI基因所编码的氨基酸序列，使用DNAMAN对氨基酸进行多重序列比对，使用MEGA6.0构建进化树，并分析其同源性。

1.2.4 紫参薯DaCHS 和DaCHI 基因的实时荧光定量PCR分析 利用实时荧光定量PCR分析DaCHS和DaCHI基因在紫参薯不同组织和块茎发育不同时期的表达情况。根据所得cDNA序列设计荧光定量PCR引物，以毬-Actin作为内参基因，引物序列见表1。以反转录的cDNA为模板，参照SYBR?Premix Ex TaqTMⅡ（Perfect Real Time）说明书，在罗氏LightCycler? 96 system荧光定量PCR仪上扩增。PCR程序为：95 ℃ 30 s；95 ℃ 5 s，60 ℃ 30 s，39个循环；反应结束后增加溶解曲线。所得数据采用2-△△CT的方法计算相对表达量和方差，3次重复，求平均值。

2 结果与分析

2.1 紫参薯总RNA的提取及检测

对提取的紫参薯RNA用2%琼脂糖凝胶电泳检测，其28S和18S条带清晰，完整性较好，且OD260/OD280 均在1.8～2.2 之间，可满足后续实验的要求。

2.2 紫参薯DaCHS和DaCHI基因的克隆

紫参薯CHS和CHI基因的PCR扩增产物经1.2%的琼脂糖凝胶电泳检测结果见图2，紫参薯CHS基因经测序鉴定序列长922 bp，包含825 bp的完整开放阅读框，42 bp的5非编码区（UFR），97 bp的3非编码区（UTR），基因命名为DaCHS；紫参薯CHI基因经测序鉴定序列长764 bp，包含663 bp的完整开放阅读框，31 bp的5非编码区（UFR），68 bp的3非编码区（UTR），基因命名为DaCHI。经分析DaCHS、DaCHI基因具有完整的5和3末端，确认是紫参薯查尔酮合成酶和查尔酮异构酶基因的全长序列。

2.3 紫参薯DaCHS和DaCHI蛋白的同源性分析

利用NCBI Conserved Domain Search对DaCHS蛋白的氨基酸序列进行分析，结果显示DaCHS蛋白的第17～274个氨基酸具有典型的CHS蛋白家族（PLN03172）成员特征，在NCBI下载12种植物CHS基因编码的氨基酸序列，通过DNAMAN软件进行氨基酸多重序列比对分析（图3），结果显示DaCHS蛋白的氨基酸序列与油棕CHS蛋白相似度高达90%。

利用NCBI Conserved Domain Search对DaCHI进行序列分析，结果显示DaCHI蛋白序列具有CHI蛋白普遍具有的2个保守结构域PLN02559和pfam02431。在NCBI下载12种植物CHI基因编码的氨基酸序列，通过DNAMAN软件进行氨基酸多重序列比对分析（图4），结果显示DaCHI蛋白的氨基酸序列与野茶树的CHI蛋白相似度较高为67%。

2.4 紫参薯DaCHS和DaCHI蛋白的系统进化分析

将紫参薯CHS蛋白与9个不同物种的CHS同源蛋白进行系统进化分析，结果见图5，紫参薯CHS蛋白与油棕（Elaeis guineensis）、木薯（Manihot esculenta）等物种的CHS蛋白聚为一类，而与甜橙（Citrus sinensis）、葡萄（Vitis vinifera）、相思树（Acacia confusa）等物种的CHS蛋白亲缘关系较远。

将紫参薯CHI蛋白与11个不同物种的CHI同源蛋白进行系统进化分析，结果见图6，紫参薯CHI蛋白与野茶树（Camellia sinensis）等物种CHI蛋白聚为一类，而与甘薯（Ipomoea batatas）、芝麻（Sesamum indicum）、橄榄（Canarium album）、龙眼（Dimocarpus longan）等物种CHI蛋白亲缘关系较远。

2.5 DaCHS和DaCHI基因在紫参薯不同组织中及块茎发育不同时期的表达分析

实时荧光定量PCR分析结果表明，在紫参薯不同组织中，DaCHS在叶、花、皮和根中均有表达，其中在花中表达量最高，在块茎中表达量最低；DaCHI在所有组织部位均有表达，其中在块茎和花中表达量较高，在茎中表达量最低（图7-A、图8-A）。在紫参薯块茎发育不同时期中，DaCHS和DaCHI均在块茎膨大期表达量达到最高，而在块茎发育的其它时期，DaCHS几乎不表达，DaCHI在块茎发育形成期具有较高的表达量（图7-B、图8-B）。表明DaCHS和DaCHI基因存在明显的组织特异性和时空性。

3 讨论

花青素的生物合成是受多基因共同调控的一个复杂过程，不是受单个基因催化调控的，在花青素合成过程中，其它基因旳表达及基因之间的协同或拮抗作用都可能对花青素的积累造成重要影响。本研究根据紫参薯Da56转录组数据，利用RT-PCR技术，获得花青素代谢途径的上游基因DaCHS和DaCHI。BLAST比对结果发现DaCHS蛋白与葡萄、油棕和木薯的CHS蛋白高度同源，相似性分别为90%、89%和89%，该结果与Lanz等[17]的研究结果相符合。DaCHI蛋白与茶树、芦笋和玫瑰的CHI蛋白具有较高的同源性，相似性分别为67%、64%和63%，也有研究发现CHI在结构上变化较大，通常同源性在42%～65%之间，即使在同一物种中不同类型的CHI也会出现较大差异[18]。

花青素含量在紫参薯不同组织中差异明显，其含量在植株的生长发育过程中是逐渐积累的。同时，CHS和CHI基因在植物不同组织有着不同的表达模式[19]。Jiang等[20]在白菜研究中发现BcCHS基因仅在花药和花瓣中特异表达，而在茎、叶等部位均不表达。石晓芳[21]在甘薯研究中发现8个甘薯品种的IbCHS基因均仅在叶、薯皮和薯肉中表达。Zhang等[22]在紫甘薯研究中发现IbCHI仅在根、茎和叶中表达。綜上所述，CHS和CHI基因均具有组织表达特异性，本研究利用实时荧光定量PCR分析DaCHS和DaCHI基因在紫参薯不同组织中的相对表达量，结果显示DaCHS在叶、花、皮和根中均有表达，其中在花中表达量最高，而DaCHI在所有组织部位均有表达，其中在块茎和花中均有较高的表达量。其表达量的差异可能是由于紫参薯不同组织部位花青素含量不同导致。

CHS和CHI基因均为多基因家族，在发育调控和组织特异性调控下不同基因有着不同的作用，基因敏感程度的差异容易受到发育阶段和外界环境刺激的诱导[19， 23]。Lalusin等[24]在研究紫甘薯块根不同发育时期中花色苷关键酶基因的表达变化中，结果发现IbCHS和IbCHI在甘薯中的表达存在普遍性，均在甘薯发育早期表达量最高，中期表达量降低。在本研究中，DaCHS和DaCHI的表达量在紫参薯块茎发育不同时期中均出现先上升后下降的现象，在块茎发育的膨大期表达量达到最高，之后迅速下降。其可能是由于花青素的合成需要有足够的糖作为前体物质，在块茎发育的萌发期和形成期是个可溶性糖迅速积累的过程，在块茎发育的膨大期达到最大，组织中的可溶性糖含量与花青素含量呈正相关关系[25]，因此，在块茎发育的膨大期可溶性糖含量积累至顶峰，同时花青素合成达到最大，从而花青素合成的关键基因DaCHS和DaCHI表达量也最高。

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