秋水仙素诱导同源四倍体葛薯的研究

陆建农 施玉珍 陈海标 罗茵茵 殷学贵

摘 要 不同时间下用不同浓度的秋水仙素处理葛薯种子，通过对突变株形态学、农艺学、解剖学、光合特性和逆境生理指标分析。结果表明：经0.15 g/L秋水仙素和48 h处理时间诱变效果最佳；与二倍体相比，四倍体葛薯在叶片厚度、气孔大小、花粉粒大小、花器官大小、块根等表现出“巨大性”，其茎长、茎粗、叶长、叶宽、叶厚、单果重、小花长、花柱长、花萼纵横径、旗瓣长、子房纵横径等指标均显著大于二倍体；叶绿素含量、净光合速率、叶片可溶性糖含量、可溶性蛋白含量、游离脯氨酸（Pro）含量、过氧化物酶（POD）活性、超氧化物歧化酶（SOD）活性和过氧化氢酶（CAT）活性均极显著大于二倍体；而丙二醛（MDA）含量低于二倍体。证明四倍体葛薯是一种非常有用的新种质，也为葛薯高产和抗性育种指明了新的方向。

关键词 葛薯；同源四倍体；诱导；光合特性；逆境生理指标

中图分类号 S632.2 文献标识码 A

Abstract The morphological， agronomic， anatomical， photosynthetic and physiological indexes of the mutant strains of “Pueraria sp.” seeds were analyzed using different concentrations of colchicine at different times. The results showed that the induction rate of tetraploid was the best with 0.15 g/L colchicine and 48 h treatment time. Compared with the diploid， the tetraploid Pueraria showed "greatness" in leaf thickness， stomatal size， pollen size， flower organ size and root tuber. The stem length， stem diameter， leaf length and leaf width， leaf weight， fruit weight， flower length， flower length， calyx vertical and horizontal diameter， vexilla length， ovary vertical and horizontal diameter and other indicators were significantly greater than diploid. The chlorophyll content， net photosynthetic rate， leaf soluble sugar content， soluble protein content， free proline （Pro） content， peroxidase activity （POD）， superoxide dismutase （SOD） activity and catalase （CAT） of the tetraploid Pueraria sp were significantly higher than that of diploid and malondialdehyde（MDA） content decreased. It is proved that tetraploid potato is a very useful new germplasm， and it also points out a new direction for high yield and resistance breeding.

Key words pueraria； autotetraploid； induction； photosynthetic characteristics； stress physiological index

doi 10.3969/j.issn.1000-2561.2018.05.002

葛薯（Pachyrrhyizus erosus Urban）是豆科（Leguminosae）豆薯屬一年生或多年生草质藤本植物，又名凉薯、地瓜、土瓜豆和沙葛等[1]。豆薯原产热带美洲，主要分布在热带和亚热带，喜炎热少雨气候，国内主要在贵州、四川、湖南、广东、广西、陕西南部和台湾等地种植[2]。葛薯适用于生食或煮熟食，具有降血压以及血脂的功效，还可以加工成淀粉和饲料[3]。另外，葛薯成熟的种子、茎、叶含有鱼藤酮，可以制成杀虫剂和提炼成抗肿瘤蛋白[4]。葛薯属于高产作物，由于块根皮薄，雨季易裂果造成腐烂，不耐贮藏，使农民增产不增收，在我国葛薯品种单一，不耐低温、水涝。因此拓宽葛薯种质资源、开拓新的育种方法是葛薯育种必由之路。

多倍体植物在自然界中广泛存在，具有细胞体积大、器官体积大、生物量大、叶片宽厚、生长速度快、抗逆性和适应性强等特性，广泛应用于植物新品种的培育[5-10]。多倍化是植物进化的普遍现象，在自然界里多倍体大多分布在环境恶劣地区，说明植物多倍体比二倍体有更强抗逆能力[11]。在蔬菜生产上，萝卜（Raphanus sativus L. ）、马铃薯（Solanum tuberosum L.）、番茄（Lycopersicon esculentum Mill.）、白菜（Brassica pekinensis Rupr.）、黄花菜（Hemerocallis citrina Baroni.）、辣椒（Capsicum annuum L.）等植物已成功诱导出多倍体，均表现较强的抗逆性[12-17]。葛薯主要以二倍体（2n=22）存在于自然界，葛薯的研究主要集中在种植、栽培和加工等方面，而关于加倍的相关研究至今未见报道。

鉴于多倍体抗逆性较强的特点和目前葛薯抗性育种的窘境，近几年本实验室开展了葛薯多倍体的诱导和抗性研究，以求在葛薯种质创新和高产、抗性育种方面有所突破。本研究在不同时间下用不同浓度的秋水仙素处理葛薯种子，通过对突变株形态学、农艺学、解剖学、光合特性和逆境生理指标分析，以期建立四倍体葛薯诱导体系，并评价其抗逆性，为葛薯倍性育种提供科学依据。

1 材料与方法

1.1 材料

以湛江本地农家种葛薯种子为供试材料，由广东海洋大学农学院作物分子育种课题组提供。

1.2 方法

1.2.1 四倍体葛薯的诱导 分别用0%（对照）、0.05%、0.10%、0.15%、0.20%和0.25%的秋水仙素溶液处理葛薯种子（温水处理葛薯种子1 h后放人工气候箱催芽24 h），避光处理24、48、72 h，每个处理96粒种子，处理完后用蒸馏水清洗葛薯种子6次，然后移植到96孔育苗盘中，栽培管理按常规方法进行。

1.2.2 筛选和采样 植株长至4～5叶期，根据诱导植株生长势、叶形、叶厚和花器官等筛选突变体；用解剖学方法测量叶片下表皮气孔大小、密度和花粉粒大小，经鉴定为四倍体材料分株编号，挂牌标识，计算成活率（成活株数/处理种子数）、四倍体诱导率（同源四倍体株数/处理种子数）、嵌合体率（嵌合體株数/处理种子数）。按挂牌编号顺序，在葛薯主茎倒三叶取样，每株重复3次，所取样品在液氮中迅速冷冻后置-80 ℃保存备用。

1.2.3 二倍体和四倍体葛薯农艺性状测定 二倍体和四倍体葛薯生长至开花时，分别测定葛薯的茎长、茎粗、叶长、叶宽、叶厚、单果重、小花长、花柱长、花萼纵径、花萼横径、旗瓣长、子房横径、子房纵径等农艺性状。

1.2.4 光合生理和抗逆生理测定 光合速率的测定利用LI-6400光合测定仪进行。每株选完全展开的倒三叶进行，重复5次，测定时间为晴天9：00～10：00；叶绿素含量测定采用乙醇-丙酮混合液浸泡法[18]；可溶性糖含量测定采用蒽酮比色法[18]；可溶性蛋白含量测定采用考马斯亮蓝G250法[18]； Pro含量测定采用酸性茚三酮法[18]； MDA含量测定采用TBA法[18]；POD活性测定采用愈创木酚氧化法[19]；SOD活性测定采用NBT光化学还原法[19]；CAT活性测定高锰酸钾滴定法[19]。

1.3 数据处理

数据采用Excel 2007整理，用SPSS19.0软件进行差异性分析。

2 结果与分析

2.1 不同浓度的秋水仙素和处理时间诱导四倍体葛薯的效果比较

在不同的时间下用不同浓度的秋水仙素处理萌动葛薯种子，对其成活率与加倍率有明显影响。从表1可以看出，在同一浓度秋水仙素处理下，随着处理时间增加，成活率降低，四倍体诱导率先升高后降低；在同一处理时间下，随着秋水仙素浓度提高，也有成活率降低，四倍体诱导率先升高后降低的趋势，嵌合体率总体呈现降低的趋势。以0.15 g/L秋水仙素和48 h处理时间诱变效果最好，成活率达到23.33%，四倍体加倍率18.75%。

2.2 二倍体和四倍体葛薯植株表型的比较分析

2.2.1 二倍体和四倍体葛薯形态学特征比较 与二倍体葛薯相比，四倍体葛薯生长明显缓慢（图1-h），叶片大、厚，皱缩扭曲，叶色加深，锯齿明显（图1-a， h）；四倍体葛薯开花时间比二倍体晚7～10 d，花器官明显比二倍体大（图1-d～g）；四倍体葛薯块根明显比二倍体大（图1-c）。

2.2.2 二倍体和四倍体葛薯解剖学特征比较 四倍体葛薯花粉粒明显比二倍体大，着色浅，且败育花粉增多（图2-a），直径、体积分别增加了56.42%、282.11%（表2）；四倍体葛薯叶片下表皮气孔明显比二倍体大（图2-b），纵、横径分别增加了53.08%、46.48%，而气孔密度减少了63.01%（表2）。

2.2.3 二倍体和四倍体葛薯农艺学性状比较 从表3可看出，同源四倍体葛薯的茎长、茎粗、单果重、花萼纵径、花萼横径、旗瓣长、子房横径较二倍体分别增加了82.06%、62.03%、345.85%、38.96%、50.83%、13.21%、114.55%，差异存在极显著；叶宽、子房纵径较二倍体分别增加了34.47%、20.57%，差异显著；叶长、叶厚、小花长、花柱长较二倍增加了4.02%、50.98%、13.66%、12.92%。

2.3 二倍体和四倍体葛薯的叶片光合生理的差异分析

在光合色素含量的比较中，四倍体的叶绿素a、叶绿素b、叶绿素（a+b）的含量与二倍体相比，分别增加了52.40%、203.64%、84.25%，差异达到极显著水平（表4）。在很大程度上植株光合色素含量差异反映了光合作用强度和生物量大小。四倍体光合速率、可溶性糖和可溶性蛋白分别比二倍体增加了136.73%、148.36%和20.35%，与二倍体之间均存在极显著差异（表5）。

2.4 葛薯二倍体与同源四倍体叶片抗性生理的差异分析

四倍体葛薯的抗性生理指标POD、SOD、CAT和Pro含量分别比二倍体提高了79.48%、40.53%、39.67%和25.50%，与二倍体之间存在极显著差异；而MDA含量降低了42.54%（表6）。

3 讨论

前人大量研究表明，植物四倍体抗性比二倍体更强，植物遇到生物和非生物胁迫时，会通过各种途径启动胁迫信号，产生抗性[12-17]。加倍后的植株，在形态和生理上会有一定的变化，如器官、细胞变大、抗逆性增强等，某些内部代谢物的产量也有所增加。本试验对葛薯倍性诱导体系、农艺性状、光合特性及逆境生理生化指标进行了研究，取得的结果有利于更全面地了解不同倍性植株体之间表型和生理生化指标的差异。

本研究表明，在不同时间用不同浓度（0.5～2.5 g/L）秋水仙素处理萌动葛薯种子，当秋水仙素浓度过低，或者处理时间过短时，四倍体的诱导率均很低，还出现嵌合体，当秋水仙素的处理浓度过高或种子的处理时间过长时，四倍体的诱导率增加，而种子的成活率降低。秋水仙素是一种剧毒诱导剂，对种子和植株生长影响较大，随着秋水仙素浓度提高，会导致细胞有丝分裂紊乱，甚至出现种子褐化死亡，有些植株在生长过程中出现死亡。所以需要将秋水仙素与处理时间合理搭配才能得到理想的成活率与四倍体诱导率，该研究以0.15 g/L秋水仙素和48 h处理时间诱变葛薯种子效果最好。

通过染色体加倍，导致有些植物遗传物质增加，表现在植株的器官和植株大小等方面[20]。葛薯是以块根为收获的营养器官，由于多倍体植株具有营养器官的巨大性，能较好满足葛薯生产的要求。本研究发现葛薯四倍体植株的形态特征与二倍体差异较大，茎长、茎粗、叶长、叶宽、叶厚、单果重、花长、花粉粒直径、体积、气孔纵、横径均比二倍体大。

光合作用是植物很重要的生理现象，对植物产量和品质影响较大，光合作用依赖光合色素吸收，所以光合色素含量的多少与光合作用的强弱有密切关系，高光效育种是目前育种家关注热点课题[21]。本研究中，四倍体葛薯的净光合速率较二倍体提高明显，这为葛薯育种指出了新的方向；四倍体葛薯叶片叶绿素含量较二倍体多，说明叶绿素含量的提高是净光合速率提高的重要原因，积累更多光合产物，为葛薯生长和产量奠定了物质基础。 可溶性糖、可溶性蛋白和游离脯氨酸是重要的渗透调节物质，植物在受到环境胁迫时可以引起这些渗透调节物应答，提高植物细胞的保水能力，常作为抗性评价的重要指标。在萝卜[22]、白菜[23]、兰花[24]、苹果[25]、泡桐[26]等植物中已证明，这些成分和抗性在四倍体中均高于二倍体。本研究中四倍体葛薯的可溶性糖、可溶性蛋白和游离脯氨酸含量分别比二倍体高，这三种碳水化合物积累为四倍体的高逆境抗性提供了间接证据。POD、SOD和CAT是一类抗逆性酶，对多种逆境胁迫起到保护作用。四倍体葛薯POD、SOD、CAT均明显高于二倍体，这与Xu等[21]和王雅美等[23]研究结果一致。而MDA是细胞毒性物质，在细胞积累多少与植物抗性有关，MDA含量越低，植物的抗性越强。四倍体葛薯MDA比二倍体低，从另一方面印证了四倍体葛薯高于二倍体的抗性，这与Xu 等[21]、王园园等[24]和张晓申等[26]的研究结果一致。

综上所述，同源四倍体葛薯的净光合速率、叶绿素含量、细胞渗透调节物质和保护性酶均高于二倍体，而MDA含量却低于二倍体。作为一种新的种质资源和育种方向，四倍体葛薯具有较高的利用价值和前景，但要揭示葛薯抗逆性机理并将其真正用于育种，还需做大量的探索研究。

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