木薯及其同源四倍体基因组与DNA甲基化差异分析

肖亮 周慧文 谢向誉 尚小红 陈松笔 严华兵

摘 要 为研究染色体加倍对木薯基因组的影响，以及多倍化与2种不同倍性木薯之间DNA碱基序列的变化的联系。本研究以木薯品种“新选048”二倍体及其同源四倍体为研究材料，使用微卫星（simple sequence repeat， SSR）、目标起始密码子多态性（stand codon targeted polymorphism， SCoT）和甲基化敏感扩增多态性（methylation sensitive amplification polymorphism，MSAP）技术分别对木薯倍性间的遗传差异、DNA甲基化水平和模式进行分析。结果表明：利用SCoT和SSR均未检测出多态性条带产生，利用MSAP技术可检测出在DNA甲基化水平和模式均发生较大改变。二倍体和同源四倍体的总甲基化率分别为60.21%、59.52%，全甲基化率分别为39.92%、41.42%，半甲基化率分别为20.29%、18.10%。木薯多倍化后，其中有27.30%的位点发生了过甲基化，四倍体有25.00%的位点表现出去甲基化。本研究结果为探究木薯倍性间遗传差异和表观遗传变化规律进行了前期探索。

关键词 木薯；二倍体；同源四倍体；DNA甲基化；遗传差异

中图分类号 S533 文献标识码 A

Abstract To study the effect of chromosome doubling in cassava genome and， explore the relationship between changes of DNA sequence in two different ploidy levels and polyploidization variation in cassava， the cassava variety ‘Xinxuan 048 and its autotetraploid were taken as the materials to analyze the genomic mutation and DNA methylation diversity using microsatellite （Simple Sequence Repeat， SSR） and Stand codon targeted polymorphism （SCoT） molecular marker and Methylation Sensitive Amplification Polymorphism （MSAP） technique. The results showed that no polymorphic band occurred using SCoT and SSR molecular marker. In the level of DNA methylation，both of the level and pattern of the autotetraploid cassava changed. The total methylation rate of the diploid and the autotetraploid was 60.21% and 59.52%， respectively；the full methylation rate was 39.92% and 41.42%， respectively；the hemi methylation rate was 20.29% and 18.10%， respectively. In comparison to the diploid， the pattern of the methylation showed that about 25.00% sites was demethylation， 30.63% sites has been methylated in autotetraploid cassava. This research is a foundation for the further exploration of genetic differences and epigenetic regulation after cassava polyploidization.

Key words cassava； diploid； autotetraploid； DNA methylation； genetic differences

doi 10.3969/j.issn.1000-2561.2018.05.001

木薯（Manihot esculenta Crantz）（2n=36）是大戟科（Euphorbiaceae）木薯属（Manihot）植物，是热带地区第三大粮食作物，全球第六大粮食作物，被誉为“淀粉之王”，是世界近6亿人赖以生存的粮食。除此之外，木薯还可饲用和加工成各种工业产品，如淀粉、酒精等[1]。因此，高产稳产和特色优质木薯品种选育显得尤为必要[2]。

染色体多倍化在植物进化过程中频繁发生，对于产生新物种贡献很大。同源四倍体植株能在细胞学、生理生化及表型方面发生显著变化[3]。木薯為无性繁殖作物，基因组高度杂合，人工诱导多倍体是木薯种质创新的理想途径[4]。伴随着同源多倍化，植物在基因组和表观遗传等水平都发生了显著变化，如染色体重组、DNA序列消除、DNA甲基化等[5]。

分子标记技术是目前研究上述领域的有效方法之一。梁武军等[6]和钟鸣等[7]利用简单重复序列（simple sequence repeat， SSR）鉴定葡萄柚（Citrus paradisi Macf）后代和柳枝稷（Panicum virgatum）的遗传多样性。韩国辉等[8]和周慧文等[9]分别利用目标起始密码子多态性分子标记（start condon targeted polymorphism，SCoT）分析枇杷（Eriobotrya japonica （Thunb.） Lindl.）和木薯的遗传多样性。然而，目前利用SSR和SCoT技术对不同倍性木薯间遗传差异的相关研究却鲜见报道。

植物中甲基化位点包括3种：CG、CHH和CHG（H表示除G以外的核苷酸）[10]。李雅婷等[11]曾利用甲基化敏感扩增多态性（methylation sensitive amplification polymorphism，MSAP）技术研究发现铁皮石斛（Dendrobium officinale Kimura et Migo）同源四倍体有28.63%的位点发生了去甲基化，30.63%的位点发生了过甲基化。王红娟等[12]以20对引物研究了二倍体与同源四倍体茅苍术（Rhizoma Areactylodis Lanceae）的甲基化差异的扩增总甲基化率为56.92%和55.03%，四倍体基因组DNA半甲基化率高于二倍体，而全甲基化率低于二倍体；四倍体与二倍体相比，DNA甲基化模式发生调整的基因位点占总检测位点的52.53%。

本研究利用SSR和SCoT技术分析木薯品种“新选048”二倍体及其同源四倍体间的遗传差异，并利用MSAP技术探究木薯二倍体与同源四倍体的DNA甲基化水平与模式的变化，旨在探究木薯倍性间DNA碱基序列变化与木薯同源多倍化之间的联系以及为揭示木薯不同倍性间甲基化变异趋势奠定理论基础。

1 材料与方法

1.1 材料

本研究在广西大学亚热带农业生物资源保护与利用国家重点实验室进行，供试的木薯品种“新选048”二倍体亲本由广西农业科学院经济作物研究所提供。其同源四倍体由本课题组前期使用秋水仙素加倍该品种获得[13]。

19条SCoT引物序列参照严华兵等[14]文中所列（表1），36对SSR引物参照王明等[15]文中所列（表2）。MSAP接头序列与引物序列见表3。

1.2 方法

1.2.1 材料获得 将二倍体亲本及其同源四倍体的6个不同株系的组培苗种植于温室大棚内，取叶片用于分子标记分析；在同源四倍体中挑选一个株系，待茎秆成熟后，将茎秆砍成20 cm一段的秆扦插至盆中，2个月后取二倍体和四倍体的顶端嫩叶，用于甲基化分析。

1.2.2 木薯全基因组DNA提取 使用常规CTAB法提取其DNA。将提取好的DNA稀释成60 ng/μL浓度，放于-20 ℃冰箱保存。

1.2.3 SSR标记扩增与检测 PCR扩增体系与程序参照王明等[15]。SSR扩增产物均用7%变性聚丙烯酰胺凝胶电泳进行检测，以恒定电压600 V跑胶20 min。电泳结束后用1 g/L AgNO3染色8～10 min，显影后拍照保存。

1.2.4 SCoT标记扩增与检测 PCR扩增体系与程序参照相关文献[14]。扩增反应结束后，取5 μL扩增产物，经1.5%琼脂糖凝胶电泳、GoldView核酸染色剂染色后在紫外凝胶成像系统上拍照保存。

1.2.5 MSAP分析 酶切体系完全参照李雅婷等[11]的方法。酶切完毕后，在酶切片段的两端加上人工设计的与EcoR I和Hpa II/Msp I酶切位点互补的人工接头（表3）。接头连接体系为20 μL，其中包含：2 μL 10×T4 Buffer、0.4 μL 20 μmol/L EcoR I和Hpa II/Msp I 接头，其余用水补齐，16 ℃过夜。随后进行的预扩增和选择性扩增使用的体系和PCR程序同样参照李雅婷等[11]的方法。扩增产物经94 ℃变性10 min后于6%变性聚丙烯酰胺凝胶进行垂直电泳，银染后观察结果。每份材料拥有2条泳道，为同裂酶HpaⅡ、MspⅠ与EcoRⅠ组合进行双酶切所产生。

参照王春国等[16]的方法，将木薯二倍体与其同源四倍体的DNA甲基化水平变化分为4大类共15个亚类。A类是指在同一位点，二倍体与四倍体的扩增模式未发生改变，即不存在扩增多态性；B类表明在同一位点四倍体表现出过甲基化或超甲基化，即四倍体的甲基化水平较二倍体上调；C类表明四倍体表现出去甲基化，即四倍体较二倍体的甲基化水平下调；D类表明MSAP技术无法确定该位点甲基化状态调整，但该位点的甲基化模式同样产生多态性。

1.3 数据处理与分析

在泳道的同一位点处，有条带记为“1”，无条带记为“0”，筛选条带数量丰富，扩增清晰的引物进行条带数据统计分析。MSAP条带统计分析方法参考王春国等[16]和边禹[17]的方法。

2 结果与分析

2.1 木薯二倍体与同源四倍体基因组的遗传差异

用SSR标记的36对引物对木薯二倍体及其同源四倍体共7份材料进行扩增，部分扩增结果如图1所示。从图2中可见，所使用的引物可以在这7份材料中扩增出清晰的條带。每对引物扩增的条带数在1～5之间，在7份材料中一共扩增出672条条带，平均每对引物在每份材料中扩增出2.7条条带，条带大小主要集中于250～750 bp之间，但是没有一条引物可以检测到有新增位点或者缺失位点。

用19条SCoT分子标记引物对木薯二倍体及其同源四倍体共7份材料进行扩增，部分扩增结果如图2所示。从图2中可见，所使用的引物均能在这7份材料中扩增出清晰的条带。每条引物扩增条带数在3～12条之间，大多数条带大小集中在500～3 000 bp之间。19条SCoT引物共扩增出1 008条条带，平均每条引物在每份材料中扩增出7.6条条带。但结果同使用SSR分子标记分析倍性间遗传差异相同，均未发现有多态性条带产生。虽然条带有亮有暗，推测可能是由于基因的剂量效应导致，而与碱基序列变化无关。所使用的6份同源四倍体材料与其二倍体亲本没有检测出新增或缺失位点，即利用SCoT分子标记也未能检测出木薯倍性间的遗传差异。

2.2 木薯二倍体与四倍体的MSAP结果

从50个引物组合中筛选出了23个扩增条带丰富，清晰可辨的引物组合，以这23个引物组合所扩增出的位点进行分析，结果如表4所示。23个引物组合共扩增出1 500个位点，其中，二倍体共扩增出754个位点，同源四倍体共扩增出746个位点。虽然倍性间的总甲基化率几近持平，四倍体略低于二倍体0.69%，但是甲基化类型发生了变化。同源四倍体双链内甲基化的位点低于二倍体4.84%，单链外甲基化的位点低于二倍体2.19%，完全甲基化的位点高于二倍体6.34%。其中，四倍体半甲基化率低于二倍体2.19%，全甲基化率高于二倍体1.5%。由此可见，木薯二倍体与其同源四倍体的总甲基化水平相差较小，但是各个甲基化类型发生了一定规模的改变。从DNA甲基化水平类型看（表5），木薯二倍体及其同源四倍体扩增类型为A类的位点占总扩增位点的43.62%，B类扩增位点数占总数的27.30%。C类的扩增位点数的比例是25.00%，D类扩增条带比例最小，为4.08%。综上所述，多态性扩增位点数目占总扩增数目的56.38%，即木薯多倍化后，共有56.38%的位点甲基化模式发生了调整。

H2和M2分别代表木薯二倍体EcoR I/Hpa II和EcoR I/Msp I酶切扩增结果。H4和M4代表木薯四倍体EcoR I/Hpa II和EcoR I/Msp I酶切扩增结果。箭頭和字母表示不同甲基化扩增模式（与表4对应）。E39Msp59-E44Msp39为不同引物组合。M为marker。

3 讨论

木薯为无性繁殖作物，基因组高度杂合，这决定了多倍体育种可作为木薯种质创新的重要途径[4]。2017年，有报道称为了满足人们生活需要，木薯长期的无性繁殖固定了大量的有害突变，同源多倍化产生冗余基因导致显性基因掩盖隐性等位基因的有害突变，大大减少了纯合隐性突变，降低有害个体发生的频率；另一方面，同源多倍化还可以通过改变生物体重要基因拷贝数的增加会导致基因功能的多样化[18]。本研究中利用SCoT和SSR分子标记分析木薯“新选048”二倍体及同源四倍体的DNA碱基序列进行检测，并未发现木薯二倍体与其同源四倍体间的遗传差异，这与曾少华[19]对柑橘国庆1号的研究结论一致，原因可能为：（1）选取标记数量太少，如果在全基因组范围内多挑选一些SSR或许二倍体和四倍体之间能表现出遗传差异。（2）本研究使用的检测手段——SSR分子标记和SCoT分子标记具有局限性，未能对木薯二倍体与同源四倍体进行全面检测。或许更换分子标记种类，如使用AFLP或许可以检测出遗传差异。

与通过高通量测序的重亚硫酸盐处理DNA来检测全基因组甲基化信息的方法相比，在AFLP分子标记技术上改进的甲基化敏感限制性酶切法（MSAP法）更为经济实惠，且该方法操作简便，可在全基因组水平上进行DNA甲基化模式分析[20]，目前已经被广泛应用于分析植物胁迫处理[21-22]、辐射诱变[23]以及化学方法诱变的DNA甲基化变异中。在本研究中应用MSAP技术分析木薯二倍体与其同源四倍体的甲基化变异时发现，两个倍性的甲基化水平十分相近，仅相差0.69%，但是有超过一半的位点的甲基化状态发生了改变，这与王春国等[16]结果相似。

前人研究发现，去甲基化可以引起转基因拟南芥的表型产生巨大变异[24]，本课题组观察到经秋水仙素诱导产生的同源四倍体木薯品种“新选048”有叶片变宽圆，叶色深绿，植株变矮和节间距变短现象[13]。根据MSAP甲基化分析结果推测，产生表型变异的原因可能是由于染色体加倍导致基因的“剂量效应”或是DNA甲基化水平和模式改变而引起。

本研究利用SSR与SCoT分子标记技术未能检测出木薯品种“新选048”二倍体与其同源四倍体之间的基因组差异。利用MSAP技术可检测出木薯品种“新选048”二倍体与其同源四倍体之间的DNA甲基化水平和模式发生了变化；其中，二倍体的总甲基化水平为60.21%；四倍体的总甲基化水平为59.52%，低于二倍体0.69%；木薯基因组加倍后，有56.38%的位点的甲基化模式发生了变异，其中有27.30%的位点发生了过甲基化，四倍体有25.00%的位点表现出去甲基化，此结论与铁皮石斛[11]，茅苍术[12]，水稻[25]，小麦[26]等研究结论基本一致。本研究为揭示木薯多倍化后表观遗传调控提供了理论依据。

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