甘蔗无根试管苗光合自养生根过程中叶片生理生化特征的变化

刘丽敏 何为中 刘红坚 余坤兴 范业赓 翁梦苓

摘 要 甘蔗光合自养生根技术是一种新型的试管苗生根方法，比传统的培养基异养生根法有显著优势。为了揭示甘蔗生根的生理生化机理，为完善其生根技术提供理论依据。本研究以甘蔗栽培品种桂糖44号无根试管苗为材料，喷施ABT2号生根粉溶液后移栽于沙土混合基质中，在普通日光温室进行自养生根。在生根过程中连续采样调查试管苗生根率和生长状态，检测叶片中总叶绿素、碳水化合物（蔗糖、可溶性糖）、三大内源激素（IAA、ABA、CTK）含量和过氧化物酶（POD）活性。结果表明，由于环境改变，试管苗受到环境胁迫，致使叶片先微黃后转绿，7 d后老叶变黄衰老，新叶开始长出，并与日俱增；第一批不定根在处理后第5天突破表皮，至第9天100%的试管苗完成不定根的再生。叶绿素含量先减少后增加而后下降，9 d后跳跃上升；蔗糖、可溶性糖含量先是呈波动上升后急剧下降再跳跃上升；ABA含量和POD活性先上升后下降；IAA和CTK含量则相反，先下降后上升。从试管苗生长状态和生理生化指标变化规律分析，本研究发现甘蔗试管苗光合自养生根过程分为3个阶段，第一阶段在0～7 d，为试管苗适应期；第二阶段在7～9 d，为试管苗异养自养切换期；第三阶段在9～15 d，为试管苗自养能力恢复期，试管苗成功过渡到自养阶段是试管苗获得高存活率的必要条件。

关键词 甘蔗；试管苗；光合自养生根；叶片；生理生化

中图分类号 S566.1 文献标识码 A

Abstract Photoautotrophic rooting technique is newly developed for in vitro sugarcane plantlets， which has a significant advantage over the conventional heterotrophic rooting technique. The purpose of this study is to reveal the physiological and biochemical mechanism of the new rooting technique， and ultimately to provide a theoretical basis for improving the technology. In this study， the sugarcane cultivar GT44 was used as the explant， and the in vitro sugarcane plantlets were transplanted in the mixed sandy soil substrate for photoautotrophic rooting in the sunlight greenhouse after sprayed with ABT 2 rooting powder solution and hardened for 24 h. During the rooting process， samples were taken continuously to investigate the rooting rate and growth status， the total chlorophyll， carbohydrates （sucrose， soluble sugars）， three types of endogenous hormones （IAA， ABA， CTK） contents and peroxidase （POD） activity in the leaves were detected. The results showed that the plantlets were stressed and got yellow slightly in the leaves due to environmental changes， then turned green. Seven days later the older leaves turned yellow and aging， but more new leaves appeared. The first signed adventitious roots broke through the epidermis at 5 d and 100% of plantlets completed their regeneration of adventitious roots before 9 d. The chlorophyll content decreased firstly then increased and decreased， but jumped up after 9 d. The sucrose and soluble sugar contents at first steadily increased then drastically declined from day 7 to day 9 and later jumped up. The ABA content and POD activity increased at first and then decreased. The contents of IAA and CTK were declined at first and then increased， which was in opposite to that of ABA. The findings of the study suggested that photoautotrophic rooting of sugarcane in vitro plantlets was divided into three phases： the first was the adaptation phase from 0 d to 7 d， the second was the heterotrophic-autotrophic switching phase from 7 d to 9 d， and the third was the autotrophic function recovery phase from 9 d to 15 d. Successful recovery of the autotrophic function was essential for high survival of sugarcane plantlets.

Key words sugarcane； in vitro plantlet； photoautotrophic rooting； leaf； physiology and biochemistry

doi 10.3969/j.issn.1000-2561.2018.05.006

糖业是广西最重要和最有代表性的传统优势产业之一，食糖年产量占全国总产量的60%以上，涉及90多个县（市、区）、2 000多万农业人口、10多万产业工人[1-2]。广西糖业发展事关我国食糖供给安全，在促进经济发展、保障财政收入、实现农民增收、促进民族团结和边疆巩固安宁等方面都发挥了重要作用。甘蔗种茎是甘蔗生产中产量和品质形成基础，因此，甘蔗良种繁育是甘蔗生产中的一项非常重要的工作。目前，甘蔗组织培养技术已经广泛应用于良种快速繁育和健康种苗生产，传统的试管苗生产流程要经过初代培养、增殖培养、生根培养和移栽4个阶段，生产工艺复杂，耗时长，生产成本高。为了降低生产成本，本课题组在国内最新研发了甘蔗试管苗光合自养生根技术。该技术是将试管苗的生根和驯化结合起来，省去了试管苗瓶内生根的传统程序。这样减少了一次无菌操作的步骤，提高了培养室的利用率，简化了组培程序，提高了生产效率，降低了生产成本。但该技术存在试管苗生根不稳定、品种间存在差异、生根苗恢复慢等问题。甘蔗试管苗光合自养生根是试管苗从异养过渡到自养的生长适应过程，试管苗从室内人工控制的最适宜生长环境转移到室外自然环境，由于试管苗一直处于非自然环境中生长，适应自然环境的能力差，环境胁迫压力大；另一方面，试管苗的不定根的再生和芽苗生长需要消耗大量的营养物质。因此，通过测量甘蔗试管苗在光自养生根过程中一些生理生化指标可以进一步研究试管苗在生根过程中的生理生化变化规律及生根机理。目前相关研究主要集中在外部因素（如温度、湿度和光强）、栽培基质和激素处理的筛选等方面[3-6]，有关甘蔗无根试管苗自养条件下生根过程中叶片生理生化指标变化特征报道极少[7-8]。Barlow等[9]认为早期陆地植物根的进化与持续增长的光合效率有关，根被用作是消除过多由光合作用产生碳的工具，证据是植物苗根（shoot-borne root）生长部位常位于碳水化合物富集部位，如叶片基部或节。

光合作用通过碳同化为植株提供能量，光合器官的驯化对试管苗的存活以及对苗和根的其他代谢途径驯化有重要影响[10]。激素在调控植物生根发育的过程中，会通过调控植物体内一系列的生化活动来配合根原基的诱导和发育[11-13]。内源激素IAA的含量高低与试管苗生根密切相关，外源激素可以通过调节内源激素水平，间接影响不定根形成及根系的形成和发育。Husen[14]报道，外源激素IBA處理黄檀（Dalbergia sissoo）插条诱导不定根发育的过程中，可溶性糖和淀粉含量不断下降，蛋白质和PER酶活性先升高后下降，这些代谢变化与扦插枝条的根原基发育有关，同时也意味着IBA的使用激活了糖代谢，释放了能力。Klerk[15]报道，在苹果微枝培养生根过程中，外源激素处理后的24 h内，基部细胞受生长素激素刺激出现淀粉，然后在不定根诱导阶段淀粉粒降解成单糖，供应细胞分裂。激素也影响着叶片的衰老，IAA和CTK为抑制叶片早衰的激素，ABA为促进叶片衰老的激素[16-17]。IAA抗衰老效果较小，CTK延缓叶片衰老效果明显，对离体叶片的抗衰老效果尤其明显[15-16]。ABA促进植物叶片的衰老，影响细胞膜的透性，加速叶片的衰老[15]。

目前的研究普遍认为植物的生长过程与植物内源激素水平及各激素间相互平衡有密切关系，因而探讨各种激素间的比例关系具有一定的价值。Hou等[18]在研究不同增殖代数板栗试管苗叶片内源激素对不定根发育的影响中发现，IAA/ABA、IAA/CTK的比值随着增殖代数变大，生根率也随之增大，说明IAA/ABA、IAA/CTK的比值大，有利于不定根的诱导发育。因此，本研究以甘蔗栽培品种桂糖44号的无根试管苗为材料，于喷施生根液前后，取样测量叶片中总叶绿素、蔗糖、可溶性糖、过氧化物酶（POD）和三大内源激素[吲哚乙酸（IAA）、脱落酸（ABA）、细胞分裂素（CTK）]等生理生化指标，研究甘蔗试管苗光合自养生根过程中生理生化指标的动态变化特征，探索试管苗光合自养生根机理，为进一步研究甘蔗不定根发育和完善生根技术提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 材料

试验材料为广西农科院甘蔗研究所培育的甘蔗（Saccharum L. hybrid.cv））新品种‘桂糖44号增殖期的无根试管苗，由广西农科院甘蔗研究所生物室提供。该试管苗的培养条件如下：培养基为MS+BA 1.0 mg/L+NAA 0.1 mg/L，继代培养周期为15 d；室内培养条件为温度（28±2）℃，湿度60%～70%；光源为日光灯，光照时间12～18 h/d，光强（2 500±300） lx。

1.2 方法

1.2.1 试管苗喷施处理 试管苗预处理方法采用He等[19]的处理方法并加以改进，即使用ABT生根粉溶液喷施甘蔗无根试管苗叶片，以叶片沾满生根液为宜，炼苗24 h后将甘蔗分丛、清洗、消毒；后种植到塑料托盘内（8伊6孔），栽培基质为沙土混合物，混合比例黄泥∶沙=1∶1，每个孔种植一丛。放置于大棚内，盖膜，保持高温高湿的环境，温度20～40 ℃，湿度70%～100%，白昼光照强度控制在20 000 lx以下，但不能长时间低于2 000 lx。

1.2.2 生根率调查 喷施处理第2天，也就是移栽后第1天开始调查生根率，每次调查30丛，3次重复，统计不可自然分割个体和生根个体数量，生根率=生根个体数/自然分割个体总数×100%。

1.2.3 采样方法 从喷施当天为0 d，移栽种植当天为1 d。喷施前开始取样，从1～9 d，每天取样一次，11～15 d隔天取样一次。每次采30丛，3个重复，取同一部位（正1，2叶）绿色叶片为检测样品，样品储存在-20 ℃的冰箱中备用。

1.2.4 检测方法 叶绿素总含量测定采用张宪政[20]的方法，蔗糖测定采用紫外光比色法，可溶性糖采用蒽铜比色法、POD活性采用可见光比色法；IAA、ABA、CTK采用酶联免疫方法测定。上述指标除叶绿素总含量外其余均委托南京建成生物工程研究所进行测量。

1.3 数据处理

图表采用Microsoft Excel 2007绘制，试验数据分析采用DPS16.05软件完成。采用单因素方差分析法（one-way ANOVA）分析不同时间段的显著性差异。

2 结果与分析

2.1 试管苗根系发育及叶片生长情况

结果表明，试管苗在喷施生根液处理之后第5天，开始观察到有肉眼可见根出现，生根率为18%左右；第6天大量根系突破表皮，生根率为69%，增幅达51%（绝对值）；第7天生根率达83%。第8天生根率达90%左右，新叶开始抽出，老叶逐渐变黄，第9～15天生根率达到100%，根系逐渐伸长、数量增多，部分老叶变枯黄，新叶逐渐生长，展开变绿。

2.2 叶片叶绿素总含量变化与试管苗生根率变化的关系

叶绿素能够吸收、传递和转换光能，是植物进行光合作用的物质基础，其含量直接影响叶片的光合速率。甘蔗无根试管苗在移栽生根的过程中，叶绿素含量呈波浪式上升趋势。从变化的差异显著性看，一共分为5个阶段。第1个阶段在喷施生根液之后的0～2 d，试管苗从室内培养的环境转移到室外大棚，受环境变化的影响，叶绿体含量急剧降低，差异显著（p<0.05）。第2个阶段在2～6 d，试管苗根系在第5天首次突破表皮，试管苗逐渐适应外界环境，叶绿体有所恢复，叶绿素含量逐渐增加，但差异不显著；第3阶段在6～7 d，试管苗根系大量突破表皮，叶绿素含量急剧升高，在第7天达到峰值，差异显著（p<0.05）；第4阶段为第7～9天，老叶开始黄化，新叶开始生长，叶绿素含量下降；第5阶段为第9天之后，试管苗生根率达100%，新叶抽出，试管苗逐渐适应外界环境，依靠自身光合作用进行生长，叶绿素含量呈稳定上升趋势（图1）。

2.3 叶片蔗糖含量变化与试管苗生根率变化的关系

蔗糖是光合同化物与能量的运输和贮藏形式，是植物生长、发育过程中的重要化合物之一。如图2所示，在0～4 d蔗糖含量差异不显著，即叶片中蔗糖含量始终保持在试管苗增殖阶段的水平。随后在4～7 d，蔗糖含量缓慢升高，第7天达到一个阶段高点，7～9 d蔗糖含量急剧下降，到第9天达到最低。随后稳步上升，到第15天达到峰值，比较图1和图2可发现叶片中叶绿素含量变化曲线与蔗糖含量变化曲线在生根过程的变化趋势非常相近。试管苗根突破表皮前叶片中蔗糖含量保持在一個稳定水平，第一批根出后至7 d蔗糖含量逐渐上升，然后生根率不断上升，但蔗糖含量却下降，直到9 d后，蔗糖才快速升高。蔗糖含量的变化一方面反应了试管苗光合作用的能力，另一方面也体现了试管苗根系发育的各个时期的碳水化合物需求情况。0～7 d是试管苗不定根诱导、根原基形成、根原基伸长和根突破表皮的关键时期，试管苗生理代谢较低，光合产物合成大于消耗，蔗糖便可以存储下来，含量增加。7～9 d，由于根系大量生长，新叶长出，消耗大于合成，蔗糖消耗很多，因此含量急剧下降。9～15 d，根系形成，有光合能力的新叶增加代谢活动减弱，光合产物累积，蔗糖含量增加。

2.4 叶片可溶性糖含量变化与试管苗生根率变化的关系

可溶性糖是植物体内重要的营养物质，可以为植物的生长发育提供能量。如图3所示，在试管苗光合自养生根过程中可溶性糖含量的呈倒双峰的变化趋势。在0～1 d含量小幅度升高，随后1～4 d含量逐渐下降，在第4天达到第一个低谷；接着在4～8 d，含量逐渐上升，到第8天含量达到最大值，与低谷含量变化差异显著（p<0.05）。到了第9天，含量急剧下降，与前一天的差异达到显著水平（p<0.05）。第9天之后，含量逐步稳定上升。

2.5 叶片POD活性变化与试管苗生根率变化的关系

过氧化物酶（POD）是普遍存在高等植物体内的一类含铁卟啉辅基的酶，亦是木质素合成的主导酶，在不定根的诱导和根原基形成过程中POD通过氧化IAA调控IAA含量而起作用。同时，POD也是植物抵抗逆境胁迫的一个重要的生理指标。如图4所示，试管苗叶片POD活性呈双峰变化趋势。喷施处理之后第1天活性剧增上升，达到第一个小高峰，差异显著（p<0.05）。第2～5天活性波动下降，到5 d达到最低点；接着5～7 d活性急剧增加，在第7天达到最高值，差异显著（p<0.05）。在7～15 d后，POD活性曲线下降，在7～9 d降低，到第11天又轻微上升，之后活性稳定下降，差异显著（p<0.05）。

2.6 叶片内源激素含量变化与试管苗生根率变化的关系

如图5所示，在甘蔗试管苗光合自养生根过程中，ABA的含量变化呈双峰变化趋势。在未喷施处理前（0 d）为最低值，接着含量逐渐上升，并在第4天达到第一个小峰值，差异达显著水平（p<0.05）。第5天下降随后又增加，到第7天达到最高值。随后含量曲线下降，在第7～9天含量下降，在9～13 d又轻微上升，但差异不显著。13 d之后含量急剧下降，差异显著（p<0.05）。CTK含量变化呈一个谷型变化。从0～7 d，CTK含量呈曲线下降，到第7天达到最低值。第7～15天，含量曲线上升，在7～9 d上升，随后11 d下降，自13 d之后，含量稳定上升。在整个生根过程叶片IAA的含量都比同期的CTK和ABA含量低，且不同时间内波动幅度较小，处理前（0 d）IAA含量达到最高，处理后下降，在第7天达到最低值，7 d后含量上升，但幅度很小，从1～15 d IAA含量变动幅度不显著。从激素的数据中可以看出，喷施处理第7天是激素变化的一个临界点，3种激素都在这个临界点达到最低或最高值，ABA含量达到峰值，IAA和CTK含量出现最低点，在生根过程中，内源激素含量波动幅度由大到小的排序依次是ABA含量，CTK含量和IAA含量。

2.7 叶片IAA/ABA和 IAA/CTK比值的变化与试管苗生根率变化的关系

生根过程也是多种植物激素相互协同、制约的过程，不同激素含量比值的变化更能反应不定根形成能力。在试管苗生根过程中，IAA/CTK和IAA/ABA变化趋势相似，0～7 d从最高峰植降到最低值，7 d后生根率达到80%以上后，IAA/CTK和IAA/ABA比值又缓慢上升，不同之处是IAA/CTK比值波动幅度小，而IAA/ABA比值波动幅度比较大。

3 讨论

本研究结果表明，在甘蔗试管苗光合自养生根过程中，光合作用重要指标叶绿素和蔗糖含量的变化是同步的，这可能与如下事实相关：甘蔗试管苗叶片是恒温、恒湿和异养的人工环境下生长发育而成，其叶片与大田生长植株叶片不一样，表现异常，没有功能气孔、表皮发育差和光合效率低等[9]。试管苗移栽到温室初期（0～7 d），叶片光合器官也需经过环境适应这个过程，因此一开始并不能建立高效的光合系统，光合作用指标是缓慢升高；在7～9 d光合指标急剧下降与这个时段的试管苗生长特征有关，试管苗根突破表皮达到高峰期，试管苗生根率达到100%，新叶也不断抽出，碳水化合物消耗量激增，而另一方面试管苗原有叶片衰老和新叶光合作用效率低等原因致使蔗糖急降；9～15 d试管苗完成了根的再生和新叶新芽不断生长后，其光合效率显著提高。这与Rodriguez等[10]的报道结论相似。可溶性糖含量的变化则体现了试管苗自身的能量储备消耗与合成的比例关系。根据其变化趋势，可能是前期激素诱导了试管苗根原基的分化，也促进了淀粉的分解，试管苗自身储备的能量充足，消耗小于合成；中期，根系和叶片生长需要消耗大量能量，试管苗自身储备能量减少，消耗大于合成；后期，試管苗根系已经建成，叶片已经具备光合作用，合成大于消耗。IAA含量在甘蔗试管苗光合自养生根过程的变化不大，说明IAA在整个过程中对根系的生长和叶片的衰老影响较小，但是一直保持在一个稳定的水平，对根系生长发育，延缓叶片衰老也起到一定的作用。CTK含量变化则与叶片生长的状态有关，前期CTK降低，叶片在在逆境中逐渐衰老，后期CTK逐渐升高，叶片逐渐适应逆境，并有新叶片长。甘蔗试管苗光合自养生根过程中ABA的含量波动幅度大。体现了试管苗在光合自养生根的过程中对环境的适应能力。Chandra等[21]的研究也表明，在试管苗移栽训化过程中，ABA在维持植株体内水分平衡和植物试管适应环境胁迫方面发挥了重要作用。叶片中内源激素及其比值的变化与传统生根的不一致，其中的原因值得进一步的研究。过氧化物酶（POD）是IAA分解代谢的关键酶，它能氧化分解IAA以此来调节植物体内的生长素水平，从而保持植物的正常生长发育，调节植物体的生长的节律。本试验结果表明，生根过程中POD活性波动很大，但IAA浓度波动幅度很小，差异不显著。这可能与POD存在的离子态有关。有报道指出POD降解IAA具有相对性，不是所有POD同工酶带都具有强IAA氧化能力，阳离子POD（碱性或称高等电点POD）与IAA的亲合力强于阴离POD[22-23]。

甘蔗试管苗光合自养生根过程是试管苗从异养生长逐步过渡到自养生长的过程，结合对试管苗叶片各个生理生化指标的分析，我们可以推断，整个光合自养生根过程可以分为3个阶段，即适应期、异养自养切换期和自养功能恢复期。第一阶段在0～7 d，试试管苗在这个阶段生长环境发生剧烈变化，试管苗生长受到环境胁迫的影响，起初叶片微黄，后慢慢转绿，不定根的诱导、根原基的形成在这一阶段完成，并有部分不定根突破表皮，形成肉眼可见根，试管苗光合系统还不完善，主要依靠自身的碳水化合物供应植株生长；第二阶段在7～9 d，这个时期大部分植株不定根突破表皮，生根率达到100%，新叶开始出现，老叶衰老，呼吸作用大于光合作用，自身碳水化合物消耗大，试管苗从依靠自身碳水化合物开始转换到依靠光合作用产物；第三阶段在9～15 d，新叶抽出，不定根伸长和旺盛生长，试管苗逐渐建立自己的光合系统，根系开始吸收土壤中的营养和水分，光合作用产物逐渐供养植株生长需要。

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