烟草β—1，3—葡聚糖酶的生物学分析

马世明 罗家佐 王德勋 户艳霞 范志勇 苏家恩

摘要 [目的]以烟草β-1，3-葡聚糖酶的氨基酸序列为材料，对其特性进行深度挖掘。[方法]采用NCBI-PROTEIN筛选蛋白序列，依次运用ProtParam、SignalP 4.1和TMHMM 2.0工具进行预测并分析烟草葡聚糖酶的理化特性、信号肽和跨膜结构的组成成分。[结果]NtBGl-2的分子量最大（40 390.76 Dk），NtBGl-3的分子量最小（37 722.64 Dk）；NtBGl-1和NtBGl-2的等电点小于7.0，而NtBGl-3的等电点大于7.0；NtBGl-1和NtBGl-2属于不稳定蛋白，NtBGl-3属于稳定性蛋白，且耐热性大于NtBGl-1和NtBGl-2；NtBGl-1和NtBGl-2的优势氨基酸为甘氨酸和丝氨酸，NtBGl-3的为天冬酰氨和丙氨酸；NtBGl均含有信号肽，属于分泌蛋白；NtBGl-1无跨膜区，而NtBGl-2（13 ～35）和NtBGl-3（7 ～29）含有跨膜结构区域，属于跨膜蛋白。[结论]该研究为深入研究烟草葡聚糖酶奠定基础。

关键词 烟草；β-1，3-葡聚糖酶；生物学

中图分类号 S-3 文献标识码 A 文章编号 0517-6611（2018）17-0096-02

Abstract [Objective] The amino acid sequence of tobacco β1，3glucanase was used as a material to deeply explore its characteristics. [Method]NCBIPROTEIN was used to screen protein sequences， and ProtParam， SignalP 4.1 and TMHMM 2.0 tools were used to predict physicochemical properties， signal peptide and transmembrane structure of tobacco glucan enzyme. [Result]The molecular weight of NtBGl2 was the maximum （40 390.76 Dk）， and that of NtBGl3 was the minimum （37 722.64 Dk）； the isoelectric point of NtBGl1 and NtBGl2 was less than 7.0， but NtBGl3 was more than 7.0； NtBGl1 and NtBGl2 were unstable proteins， NtBGl3 was a stable protein， and the heat resistance was greater than that of NtBGl1 and NtBGl2； the dominant amino acids of NtBGl1 and NtBGl2 were glycine and serine， NtBGl3 for asparagine and alanine； NtBGl contained signal peptide， belonged to secreted proteins； NtBGl1 had no transmembrane domain， while NtBGl2 （13 ～35） and NtBGl3 （7 ～29） contained transmembrane structure， and belonged to transmembrane proteins.[Conclusion]This study lays the foundation for indepth study of tobacco glucanase.

Key words Tobacco； β 1，3 Glucan； Biology

β-1，3-葡聚糖酶具有水解β型的1，3糖苷鍵的葡聚糖聚合体的作用[1-2]，由于葡聚糖是植物细胞壁的重要组成部分，因此葡聚糖酶具有促进植物体软化的作用[3]。此外，葡聚糖酶具有抵抗部分细菌和真菌的入侵[4-6]。正常情况下，葡聚糖酶较少在植物体内积累，且活性较低，当受到病原微生物入侵时，葡聚糖酶的表达量增加，在体内大量合成，同时产生部分同工酶，进而发挥抵抗病原菌入侵的作用[7-9]，如水稻被稻瘟菌感染，诱导葡聚糖酶的活性增加3～5倍[10]；烟草的坏疽病感染黄瓜叶，促使葡聚糖酶的活性增加6倍[11]。

目前，关于烟草葡聚糖酶的研究主要集中在其抵抗病原微生物，主要包括花叶病[12]、疫霉病[13]、立枯丝核菌[14]、坏疽病[11]等。为更深层次地认识烟草β-1，3-葡聚糖酶的生物学特性，笔者利用生物信息学的方法进行研究，进而为深入研究烟草葡聚糖酶奠定基础。

1 材料与方法

1.1 筛选烟草β-1，3-葡聚糖酶家族成员

采用NCBI-PROTEIN[15]数据库在线检索，筛选烟草葡聚糖酶相关的蛋白序列，获取的登录号分别是AAA63541.1、ACF93731.1和AAA63542.1，依据优势氨基酸和氨基酸数进行命名，分别为NtBGl-1、NtBGl-2和NtBGl-3[16]。

1.2 方法 以ProtParam的工具[17]测定序列的理化特性，如烟草葡聚糖酶的氨基酸数、分子量、理论等电点、不稳定指数、脂肪族指数和优势氨基酸；使用SignalP 4.1的在线服务[18]，其D-cutoff值以Matthews的相关系数进行测定；采用TMHMM 2.0工具[19]，根据疏水性氨基酸，对烟草葡聚糖酶的跨膜结构进行分析。

2 结果与分析

2.1 烟草β-1，3-葡聚糖酶理化特性的分析

通过在线工具（PROTPARAM）预测NtBGl的相关理化特性，结果显示（表1），NtBGl-2的氨基酸数最多（370），其次是NtBGl-1，为359个，NtBGl-3的最小，含有343个氨基酸；对于烟草葡聚糖酶，以NtBGl-2的分子量最大，其分子量为40 390.76 Da，而NtBGl-3的分子量最小（37 722.64 Da）；通过测定烟草葡聚糖酶的等电点，NtBGl-1和NtBGl-3的等电点分别为6.60和5.12，均属于酸性蛋白，而NtBGl-2的等电点值最大（7.10），属于碱性蛋白；NtBGl-1和NtBGl-2的不稳定指数均大于40，其值分别为42.49和44.28，因此NtBGl-1和NtBGl-2属于不稳定性蛋白，而NtBGl-3的不稳定指数为37.47，即NtBGl-3属于稳定性蛋白；NtBGl-3的脂肪族指数最大（90.20），说明NtBGl-3的耐热性大于NtBGl-1和NtBGl-2；NtBGl-1和NtBGl-2的优势氨基酸相同，均为甘氨酸（含量分别为9.2%、8.9%）和丝氨酸（含量分别为9.2%、9.5%），NtBGl-3的优势氨基酸为天冬酰氨（9.6%）和丙氨酸（10.2%）。

2.2 烟草β-1，3-葡聚糖酶的信号肽分析

从信号肽、原始的剪切位点和综合的剪切位点3个方面分析烟草葡聚糖酶的信号肽发现（图1），NtBGl-1第10位亮氨酸的信号肽值（S）达到最大（0.970），而原始的剪切位点（C）和综合的剪切位点（Y）的最大分值均处于第22位谷氨酰胺，其值分别为0.810和0.856，因此NtBGl-1具有信号肽，剪切位点处于第21与22位氨基酸之间，信号肽处于第1～21位的氨基酸，该信号肽的均值为0.902；NtBGl-2的信号肽值于第20位亮氨酸处达到最大（0.957），原始的剪切位点和综合的剪切位点的最大分值均处于第33位谷氨酰胺，其值分别为0.742和0.795，即NtBGl-2具有信号肽，剪切位点处于第32～33位氨基酸，信号肽处于第1～32位的氨基酸，该信号肽的均值为0.846；NtBGl-3的信号肽值于第9位苯丙氨酸处达到最大（0.986），原始的剪切位点和综合的剪切位点的最大分值均处于第30位谷氨酰胺，其值分别为0.615和0.753，表明NtBGl-3具有信号肽，剪切位点处于第29与30位氨基酸之间， 且信号肽处于第1～29位的氨基酸，该信号肽的均值为0.929。综上所述，烟草葡聚糖酶均具有信号肽，即属于分泌蛋白。

2.3 烟草β-1，3-葡聚糖酶的跨膜结构分析

蛋白酶可通过跨膜结构锚定于质膜上，进而在亚细胞结构的特定区域参与信号传递或代谢活动，因此对NtBGl的跨膜结构进行分析，结果显示（图2），NtBGl-1序列位于膜内的氨基酸数为3.50，小于20.00，即NtBGl-1不具有跨膜结构；NtBGl-2和NtBGl-3位于膜内序列的氨基酸数分别为20.97和22.74，均大于20.00，表明NtBGl-2和NtBGl-3含有跨膜结构，其概率分别为0.947和0.993；NtBGl-2的第1～12位氨基酸位于

膜内，第13 ～35位氨基酸为跨膜区，第36～370位的氨基酸处于膜外；NtBGl-3的第1～6位氨基酸位于膜内，第7～29位氨基酸为跨膜区，第30～343位的氨基酸处于膜外。综上所述，除NtBGl-1外，NtBGl含有跨膜结构。

3 结论与讨论

通過理化特性分析，NtBGl-2等电点大于7.0，因此，NtBGl-2可能定位于液泡，且具有降解病原菌菌丝的功能[20]，但NtBGl-2属于不稳定性蛋白，因此NtBGl-2可能诱导同工酶、几丁质、核糖体等共同作用，进行抵抗病原微生物[7-8]；NtBGl均属于分泌蛋白，具有信号肽，从而指引烟草葡聚糖酶运输于特定区域，参与相应的抗性反应[21]；NtBGl-2（第13 ～35位氨基酸）和NtBGl-3（7 ～29）均含有跨膜结构，因此，NtBGl-2和NtBGl-3可能参与信号的传递[22]。

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