酿造酱油中特征氨基酸含量检测及对氨基酸态氮贡献的分析

梁寒峭，陈建国，刘伟，马保文，荣长远，程池*

1(中国食品发酵工业研究院，中国工业微生物菌种保藏管理中心，北京， 100015) 2(聊城正信生态农业科技园有限公司，山东 聊城， 252000)

酿造酱油(fermented soy sauce)是以大豆和/或脱脂大豆、小麦和/或麸皮为原料，经微生物发酵制成的具有特殊色、香、味的液态调味品。最早的酱油由肉类腌制而成，称为“醢”[hǎi]，后逐步改良发展，以豆类为主要原料制成的成品风味相似且成本较低。无添加酿造酱油中的鲜味物质主要来源于原料中的蛋白质经微生物代谢分泌产生蛋白酶、肽酶、谷氨酰胺酶等多酶系作用，生成各种氨基酸，其中以谷氨酸的鲜味最突出。目前，市售的酱油多有添加谷氨酸钠(味精)的现象，此举除了增加酱油的鲜味外，还可以大幅度提高氨基酸态氮的含量，从而显著提高酱油的等级。根据报道，普通无盐味精中的氨基酸态氮含量为7.27 g/100g[1]，500 mL酱油中外添加10 g味精即可提高氨基酸态氮0.15 g/100g，在氨基酸态氮的指标上将一款一级酱油轻松地提升为特级酱油，成本却只需要2角钱。

随着人类社会的进步和社会经济的不断发展，人们的生活水平也越来越高，调味方式的改变也逐渐成为健康饮食的要素之一，人们从片面追求色、香、味的传统调味方式转而向讲究原色、原汁、原味的现代健康调味方式[2-3]。目前在我国，无添加酿造酱油还没有相关标准，均执行酿造酱油国标，并且市场较为混乱，名称繁多，有称零添加酱油(0添加)或纯酿酱油等，但其含义均指大豆、小麦等原料经微生物发酵结束后，不再使用任何食品配料、食品添加剂等进行调配，制备而成的酿造酱油。无添加酿造酱油配料表中只含有大豆或脱脂大豆、小麦和(或)麸皮、食盐等原料，不含有白砂糖、酵母提取物等食品配料，以及甜味剂(三氯蔗糖、安赛蜜等)、增鲜剂(谷氨酸钠、5′-肌苷酸二钠、5′-鸟苷酸二钠等)、防腐剂(苯甲酸钠、山梨酸钾等)、焦糖色素等。

目前，在国标GB 18186—2000《酿造酱油》中规定：酱油等级的理化指标主要包含3项，分别为可溶性无盐固形物、全氮和氨基酸态氮。第2号修订单中又进一步要求自2002年1月31号起酱油产品标签中，要标明氨基酸态氮的含量和质量等级，因此，氨基酸态氮成为国标规定的酿造酱油品质指征的3大指标中唯一被标注在产品标签上的数据，因此其数值的高低很大程度上成为消费者在酱油选择中的最主要依据。但随着现代食品工业科技的发展，谷氨酸钠、呈味核苷酸等食品添加剂的应用增多，氨基酸态氮的表观数值已经不能全面反映酿造酱油的真实营养价值。本研究分别对有无食品添加剂的不同种类酱油的氨基酸种类、氨基酸构成比例和氨基酸态氮组成等多方面进行了系统研究，为酿造酱油的品质鉴别提供科学依据。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

样品材料1号由山东正信生态农业科技园有限公司提供，样品材料2号和3号购自北京超市，具体信息见表1。

表1 样品材料的基本信息Table 1 Essential information of samples

17种氨基酸标准液(0.002 50 mol/L，Sigma)；浓盐酸(浓度≥36%)；冰乙酸，柠檬酸钠和氢氧化钠(优级纯)；浓硫酸，重蒸酚，茚三酮，还原茚三酮，氢氧化锂，二甲基亚砜，乙酸锂，硝酸银，铬酸钾，甲基红，澳钾酚绿，硫酸铜，硫酸钾，硼酸，甲醛，冷冻剂(市售食盐与冰按1∶3质量比混合)；高纯氮气(99.99%)。全部试剂除注明外均为分析纯，实验用水为去离子水。

1.2 仪器与设备

日立L-8900 高速氨基酸分析仪，日本日立公司；日立钠离子交接树脂(4.6 mm×60 mm)，日本日立公司；LG10-24A变速台式离心机，德国Eppendorf公司；R5真空泵，德国普立；DHG-9035A恒温干燥箱，北京恒泰丰科；酸度计(附磁力搅拌器)，凯氏烧瓶；冷凝器；氮球。

1.3 方法

1.3.1 酱油中的游离氨基酸分析方法

参照《食品中氨基酸的测定GB 5009.124—2003》[4]。

1.3.2 酱油中可溶性无盐固形物含量检测

参照《酿造酱油GB 18186—2000》6.2可溶性无盐固形物部分；全氮含量检测参照《酿造酱油GB 18186—2000》6.3全氮部分；氨基酸态氮含量检测参照《酿造酱油GB 18186—2000》6.4氨基酸态氮部分[5]。

1.3.3 酱油低聚肽含量检测

参照《海洋鱼低聚肽粉 GB/T 22729-2008》6.3低聚肽部分[6]。

1.4 数据计算

1.4.1 游离氨基酸对氨基酸态氮的贡献值的转换计算方式

非酸性氨基酸对氨基酸态氮的贡献值=氨基酸含量/氨基酸分子量×14

酸性氨基酸对氨基酸态氮的贡献值=氨基酸含量/氨基酸分子量×14×2

1.4.2 低聚肽对氨基酸态氮的贡献值的转换计算方式

分子质量140 Da以下低聚肽对氨基酸态氮的贡献值=低聚肽含量/平均分子质量140×14

分子质量140～500 Da以下低聚肽对氨基酸态氮的贡献值=低聚肽含量/平均分子质量320×14

分子质量500～1 000 Da以下低聚肽对氨基酸态氮的贡献值=低聚肽含量/平均分子量750×14

2 结果与分析

2.1 游离氨基酸的含量分析

采用全自动氨基酸分析仪对3个样品中的17种氨基酸的种类和含量进行检测分析，结果见表2。3个样品的氨基酸总量分别为3.875 g/100 mL、6.041 g/100 mL和2.341 g/100 mL，2号样品最高；但考虑2号样品配料表中明确标注添加谷氨酸钠，排除谷氨酸干扰后，3款酱油的氨基酸总量分别为3.494 g/100 mL、3.062 g/100 mL和2.106 g/100 mL，无添加的1号样品氨基酸总量最高。

酿造酱油中的谷氨酸占总氨基酸的比例一般在18%～25%，超过此范围多为外添加谷氨酸钠增鲜剂所致[7-8]。本研究中3个样品的谷氨酸占比分别为9.83%、49.31%和10.04%，2号样品谷氨酸占比超出常规范围近1倍，对照其配料表推断与其添加的谷氨酸钠和各类增鲜剂相关。谷氨酸钠成本低廉，谷氨酸作为酿造酱油的特征氨基酸，其含量及占比范围可用作初步判断产品是否添加增鲜剂的指标之一。

表2 酿造酱油样品中的氨基酸组成 (g/100 mL) (n=3, X±sd)Table 2 Free amino acids composition of fermentedsoy sauce

注：*必需氨基酸

在所检测的16种氨基酸中(不计谷氨酸)，13种氨基酸在1号样品中含量最高，此外甘氨酸和组氨酸在1号和2号样品中基本无差异，只有天冬氨酸在2号样品中的含量显著高于1号样品，3号样品游离氨基酸含量普遍偏低。有研究表明，在配制酱油和植物蛋白水解液中天冬氨酸、丝氨酸、脯氨酸、甘氨酸4种氨基酸含量接近，占总氨基酸(不计谷氨酸)比例的总和较高，分别为47.85%和55.52%[8]；本研究中的3个样品4种氨基酸占比总和分别为25.41%、26.88%和25.02%，与前期研究中酿造酱油的含量27.42%相符[9]，且4种氨基酸间的含量差异性较大，表明3款酱油确为酿造酱油。

在排除谷氨酸干扰下，3个样品的氨基酸种类分布基本一致，亮氨酸、赖氨酸、脯氨酸、缬氨酸和异亮氨酸含量分布在9%～11%范围内，是酿造酱油中的主要氨基酸；丙氨酸、苯丙氨酸、丝氨酸和苏氨酸、甘氨酸分别分布在6%～9%和3%～6%范围内；胱氨酸、组氨酸、蛋氨酸、酪氨酸和精氨酸含量一般低于3%。天冬氨酸在3款酱油中含量差异较大，2号酱油含量最高，是1号和3号样品的1.71和1.83倍。

图1 酿造酱油样品中各氨基酸占总氨基酸的百分比(以谷氨酸计)
Fig.1 Free amino acids proportion in fermented soy sauce (including glutamic acid)

2.2 必需氨基酸组成分析

3个样品中必需氨基酸总量分别为2.08、1.76和1.12 g/100 mL，其中，无添加的1号样品必需氨基酸占比最高为53.65%，2号样品最低为29.18%；在排除谷氨酸后，3个样品的必需氨基酸占比基本一致。根据 WHO/FAO 提出的理想蛋白质中 E/T 为 40%左右，E/N 在 60%以上的要求[9]，样品1中氨基酸的组成最理想，7种必需氨基酸含量均高于2号和3号样品，是2号样品的1.08～1.27倍，3号样品的1.48～2.19倍。

表3 酿造酱油中必需氨基酸总量占总氨基酸含量的百分比(n=3, X±sd)Table 3 Essential amino acids proportion in fermentedsoy sauce

注：EAA必需氨基酸总量， E/T必需氨基酸总量/氨基酸总量，E/N必需氨基酸/非必需氨基酸。

图2 酿造酱油样品中各必需氨基酸含量
Fig.2 Essential amino acids content in fermented soy sauce

赖氨酸是帮助其他营养物质被人体充分吸收和利用的关键物质, 科学家称其是人体“第一必需氨基酸”和“最特别的、不可缺少的氨基酸”，其在谷物食品中含量较低，且易被破坏，故被称为第一限制性氨基酸[10]。本研究中3个样品的赖氨酸含量分别为0.35、0.28和0.16 g/100 mL，占总氨基酸的9.14%、4.62%和6.92%，其中1号分别是2号样品和3号样品的1.98倍和1.32倍。由此可见，酿造酱油中的必需氨基酸种类和含量均很丰富，在无外添加氨基酸的情况下通过酿造工艺即可达到均衡的分布水平，更符合人体的需求。

2.3 氨基酸态氮组成

依照国标GB 18186—2000《酿造酱油》方法对3个样品的氨基酸态氮、全氮和可溶性无盐固形物进行测定，检测结果表明3款酱油的等级均与其产品标签标注相符，1号和2号样品为特级酱油，3号样品为三级酱油。其中2号酱油氨基酸态氮最高为1.42 g/100mL，比1号无添加特级酱油高0.48 g/100mL。

由于氨基酸态氮现已成为评判酿造酱油品质的重要指标之一，因此对其构成的剖析显得尤为重要。氨基酸态氮指的是以氨基酸形式存在的氮元素的含量，主要由游离氨基酸和小分子低聚肽中的氮元素构成，国标中采用甲醛法滴定得到氨基酸态氮的检测值，结果见表4。将17种游离氨基酸和低聚肽的检测结果换算为以氮元素计的氨基酸态氮值，得到三款酱油中氨基酸态氮的组成结构，所有单品种游离氨基酸和小分子低聚肽对氨基酸态氮的贡献分布见图3。

表4 酿造酱油中氨基酸态氮、全氮和可溶性固形物的检测结果和氨基酸态氮组成分析(n=3, X±sd) 单位：g/100mL

注：氨基酸态氮检测值(不计谷氨酸)=氨基酸态氮检测值-谷氨酸贡献值

图3 酿造酱油中氨基酸态氮的主要构成
Fig.3 Amino nitrogen composition in fermented soy sauce

从结果可知，3个样品的氨基酸态氮计算值(包括谷氨酸)分别为0.91、1.16和0.47 g/100 mL，1号和3号样品的计算值与检测值基本相符，说明这两个样品的氨基酸态氮主要由游离氨基酸和低聚肽贡献，2号样品的检测值比计算值高0.26 g/100mL推断其中仍有18.31%由大分子蛋白贡献。

2号样品氨基酸态氮检测值最高为1.42 g/100mL，但其中0.57 g/100mL由谷氨酸贡献，贡献率高达40.14%；1号样品和3号样品的谷氨酸贡献率仅为7.45%和9.52%。排除谷氨酸干扰不计后，2号样品氨基酸态氮降至0.85 g/100mL，与1号样品含量相当。此外2号样品全氮值亦为最高为1.97 g/100mL，比1号样品高23.90%，但排除谷氨酸的贡献值后比1号样品反低7.90%。由此可见，2号样品虽氨基酸态氮和全氮检测值虽为最高，但主要由谷氨酸贡献，且其中相当部分为外源添加。

本研究中3个样品的总游离氨基酸对氨基酸态氮的贡献值由高到低顺序为2号样>1号样>3号样，2号样品为66.20%；但排除谷氨酸干扰后，1号和3号样品的贡献率变化不大，2号酱油的贡献率下降至26.41%，比1号样品低18.62%。

酿造酱油的主要原料大豆或黄豆中的大豆蛋白在经过多种微生物区系和酶系的分解作用下生成丰富的游离氨基酸和低聚肽，其中分子质量1 000 Da以下的小分子低聚肽是预消化的蛋白质，可直接吸收，并且在酸性环境或加热处理的情况下，仍保持稳定，不会被破坏。比大分子蛋白质更易消化，吸收利用率更高，营养作用更强。在本研究中，1号样品3类小分子低聚肽对氨基酸态氮的贡献均高于另两个样品，总贡献值分别是2号和3号样品的1.95倍和2.39倍。

上述结果均表明，氨基酸态氮含量高并不一定代表氨基酸、低聚肽类营养物质丰富，外部添加的增鲜剂如谷氨酸钠也会对这一表征指标有显著影响。3款酿造酱油在排除谷氨酸干扰后，1号和2号两款特级酱油氨基酸含量基本相等，均显著高于3号的三级酱油，但三个样品氨基酸的分布趋势基本一致。研究表明，无增鲜剂外添加的酿造酱油氨基酸态氮基本可达到0.8 g/100 mL的特级水平，但能超过1.0 g/100 mL的产品却非常少，酱油中主要的含氮成分是游离氨基酸及肽，其中游离氨基酸占50%～75%，肽占15%～35%，还有部分为铵态氮[11-12]。游离氨基酸和低聚肽做为酱油主要的营养成分和呈味物质，其组成成分和比例直接影响酱油的品质。

对于消费者知道来说，氨基酸态氮的高低是辨别酱油优劣等级最直观也是最重要的一个指标。正常条件下，提高酱油等级和品质，增加氨基酸态氮含量需要筛选更优质的原料、提升酿造工艺和增加发酵时间，但随之会大大提高生产成本；另有部分企业通过添加成本远低于酿造酱油的味精，以增加氨基酸态氮含量，增鲜、提级、降成本三不误，且其属于国家允许的添加剂，因此众多特级酱油都有可能是添加有谷氨酸钠成分的“加料酱油”[13]。在以往的研究中多关注酿造酱油的真伪鉴别，而在符合酿造酱油标准的产品中如何正确认识氨基酸态氮数值的指征含义以及现有酿造酱油等级的评价标准体系是否可以满足市场发展的要求方面探讨尚有欠缺，本研究从氨基酸态氮的组成解析角度提出了新的研究思路。

3 结论

通过对3个酿造酱油样品的氨基酸含量、构成和氨基酸态氮组成分析，结果表明2号样品虽然各项检测指标最高，但排除谷氨酸干扰后均低于无添加的1号样品，2号样品谷氨酸对氨基酸态氮的贡献率高达40.14%。谷氨酸做为酱油中最主要的鲜味氨基酸，其含量范围可用于初步判定产品是否外添加增鲜剂。不计谷氨酸后，3款酿造酱油各氨基酸含量相对分布均匀。目前酱油产品包装中标注的氨基酸态氮虽均能达到国家标准，但仅以此来衡量酱油品质并不能准确全面地体现产品质量。