远东拟沙丁鱼低聚肽化学组成及其增强免疫力功能评价

袁学文，王炎冰

1(广东第二师范学院 生物与食品工程学院，广东 广州，510303) 2(肇庆兴亿海洋生物工程有限公司，广东 肇庆，526238)

免疫活性肽是一类具有增强机体免疫力、提高机体抵抗外源病原体感染能力、增强巨噬细胞吞噬能力等免疫功能的肽[1]。机体功能正常的情况下，会对外源性抗原产生排异反应，发挥免疫保护作用[2]。食源性免疫活性肽不具备免疫原性，能以肽的形式被人体肠道吸收与受体结合，从而发挥增强机体免疫作用[3]。目前国内外对乳清蛋白和酪蛋白水解得到的免疫活性肽研究较多[4-5]。据报道，乳源性活性肽可以显著提高淋巴细胞增殖率，激发巨噬细胞吞噬活性，提高机体抵抗外源性抗原感染的能力[6-7]。另外，小麦肽[8]、大豆肽[9]等植物源生物活性肽也可以显著提高抗体生成细胞活性及促进脾淋巴细胞增殖，从而增强机体的免疫功能。

海洋生物活性肽，从海洋原料中提取获得，由于海洋生物特殊的生长环境(高压、高盐、缺氧等)，赋予其优异的生物活性[10]。远东拟沙丁鱼(Sardinopssagax)，又名斑点莎脑鱼，主要分布于日本近海和我国的黄海海域，具有生长快、繁殖力强、价格低廉等优点。远东拟沙丁鱼年捕捞量达500万t左右，通常加工为饲料，生产价值低，其资源并未得到充分利用[11]。据报道，远东拟沙丁鱼蛋白肽具有降低血压、促进细胞修复、抑制血管紧张素转换酶(angiotensin coverting enzyme, ACE)、抗氧化等多种生物活性，是制备生物活性肽的优质原料。MATSUFUJI等[12]利用碱性蛋白酶酶解沙丁鱼，得到具有降血压作用的活性肽。王晶晶等[13]以远东拟沙丁鱼为原料，通过膜分离等工序得到蛋白多肽，可以很好地抑制ACE。GARCA等[14]从沙丁鱼、马鲛鱼、小斑点猫鲨等5种鱼类中提取蛋白肽，经测定发现沙丁鱼蛋白肽的抗氧化活性最高，其亚铁螯合物含量为0.32 mg/mL。远东拟沙丁鱼可能具有增强免疫力的功能，具有很大的研究价值。

本文以远东拟沙丁鱼为原料，通过蛋白酶酶解和膜分离等技术制备远东拟沙丁鱼低聚肽，并研究其化学组成和免疫活性功能，以细胞实验来验证对小鼠免疫能力的增强作用，为远东拟沙丁鱼资源的开发利用提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

远东拟沙丁鱼(Sardinopssagax)，体长14～20 cm，2016年11月购于广东省茂名市博贺港，冷冻运输到实验室，于-20 ℃保存备用。

人参乌鸡口服液，北京同仁堂健康药业股份有限公司；动物蛋白水解酶(14.5 万U/g)、风味酶(14 万U/g)，南宁庞博生物工程有限公司；RPMI1640培养基，GIBCO公司；胎牛血清(FBS)，GIBCO公司；青/链霉素双抗，杭州吉诺生物医药有限公司产品；Hank’s，杭州吉诺生物医药有限公司产品；ConA，广州威佳科技有限公司；其他试剂均为国产分析纯。

1.2 主要仪器与设备

Thermo M原子吸收光谱仪，德国Thermo公司；UV-2450 型紫外分光光度计，日本岛津公司；OMLG-25喷雾干燥器，上海欧蒙实业有限公司； FOSS 2300全自动凯氏定氮仪，瑞士FOSS公司；台式高速大容量冷冻离心机，艾德本中国有限公司；SW-CJ-2FD型超净工作台，苏州净化有限公司；HHT4-LX-C50L型立式压力蒸汽灭菌器，北京中西远大科技有限公司；MCO-175 CO2培养箱，日本三洋公司；PHS-3C pH计，上海科学仪器有限公司；管式离心机GQ75B，上海章泉有限公司；多功能酶标仪，美国Thermo公司；FA2104A分析天平，上海天平仪器厂；SHZ-B水浴恒温振荡器，江苏佳美仪器公司；高效液相色谱仪(LC-20AT)，美国Waters公司；QL-901混合器，上海精科实业有限公司；Multiskan Go全波长酶标仪，Thermo Fisher Scientific公司；CKX41型倒置显微镜，日本 Dickinson公司。

1.3 实验动物

BALB/c 雄性小鼠、Hartley 雄性豚鼠，SPF级；小鼠初始体重为18.0～22.0 g，Hartley 豚鼠初始体重为355.6～472.2 g，购自广东省医学实验动物中心。小鼠质量合格证编号：44007200008675；豚鼠质量合格证明编号：44007200009223。动物饲养在广东省医学动物实验中心SPF级动物房，实验动物使用许可证号：SYXK(粤)2013-0002。动物饲养条件：4～5只/箱，群养；饲养温度与湿度：20～26 ℃，40%～70%，采用10 h：14 h昼夜间断照明，自由进食、饮水。

1.4 实验方法

1.4.1 远东拟沙丁鱼低聚肽的制备

远东拟沙丁鱼→去头去骨→酶解→灭酶(90～100 ℃)→离心→脱油→脱色、脱苦(珍珠岩)→0.2 μm陶瓷膜过滤→截留分子质量为5 000 u的超滤膜进行超滤→真空浓缩→喷雾干燥→低聚肽。

将远东拟沙丁鱼去头、皮、骨及内脏，清洗后绞碎，匀浆，在一定条件下酶解3 h(温度50 ℃，添加动物蛋白水解酶0.5%、风味酶0.1%，自然条件)，之后在90～100 ℃条件下加热10 min，使蛋白质变性。之后再在4 000 r/min离心，取上清液于管式离心机中脱油，再加入珍珠岩(添加比例为3 g/100g)脱色，得到的澄清液先用陶瓷膜(孔径0.2 μm)过滤，再用截留分子质量为5 000 u的超滤膜超滤，取滤液浓缩再喷雾干燥，得到远东拟沙丁鱼低聚肽粉，于4 ℃干燥条件下保存备用[15]。

1.4.2 远东拟沙丁鱼低聚肽分子质量分布测定

委托江南大学分析测试中心测定，参考国标GB/T 22492—2008的方法。

1.4.3 远东拟沙丁鱼低聚肽各项指标测定

游离氨基酸测定：GB/T 5009.124—2003；牛磺酸含量测定：GB/T 5009.169—2003；色氨酸含量测定：GB/T 15400—1994；钙含量测定：GB/T 5009.92—2003；钾含量测定：GB/T 5009.91—2003；钠含量测定：GB/T 5009.91—2003；硒含量测定：GB 5009.93—2010；锌含量测定：GB/T 5009.14—2003；能量测定：GB/Z 21922—2008；蛋白质含量测定：GB 5009.5—2010；脂肪含量测定：GB/T 5009.6—2003；碳水化合物含量测定：GB/Z 21922—2008；低聚肽含量：GB/T 22729—2008/6.3；灰分含量测定：GB 5009.4—2010；铅含量测定：GB 5009.12—2010；无机砷测定：GB/T 5009.11—2003；镉含量测定：GB/T 5009.15—2003；甲基汞含量测定：GB/T 5009.17—2003。

1.4.4 远东拟沙丁鱼低聚肽增强免疫力功能评价

委托广东省医学实验动物中心测定，参考中华人民共和国卫生部颁发《保健食品检测与评价技术规范》 2003版中保健食品功能成分评价方法。

1.4.4.1 远东拟沙丁鱼低聚肽对正常小鼠ConA诱导脾淋巴细胞转化的影响

参考侯虎[16]的方法，稍作改动。

取BALB/c雄性小鼠70只，按体重随机分为阴性对照组、乌鸡人参口服液组、供试品高、中、低剂量组，每14只分为一组，共5组。各组小鼠每天按0.2 mL/10g体重灌胃给予相应样品液，阴性对照组给予等量纯净水，1次/d，连续30 d。每天观察记录动物的日常情况1次；每周称量小鼠体重1次。于末次给药1 h，无菌取脾，置于盛有适量无菌Hank’s液平皿中，将脾磨碎，制成单细胞悬液。经200目筛网过滤，用Hank’s液洗2次，每次离心10 min(1 000 r/min)。然后将细胞悬浮于1 mL完全培养液中，用台芬兰染色计数活细胞数，调整细胞浓度3.0×106个/mL。每份脾细胞悬液分成2组，一组加10 μL ConA液(5μg/mL),另外一组为对照，于5% CO2，37 ℃培养箱中培养27 h。培养结束前4 h加50 μL(5 μg/mL)MTT，结束后于1 000g离心10 min。取沉淀加入180 μL DMSO，溶解液后于波长580 nm下测定吸光度值。

1.4.4.2 远东拟沙丁鱼低聚肽对正常小鼠体液免疫功能的影响

参考侯虎[16]的方法，稍作改动。

补体的制备：采集豚鼠血，分离出血清(5只豚鼠的混合血清)，将1 mL压积SRBC加入到5 mL豚鼠血清中，4 ℃冰箱放置30 min，振荡后离心取上清液，分装，-80 ℃保存(d48)。使用时用SA缓冲液按1∶8稀释。

取BALB/c雄性小鼠70只，按体重随机分为阴性对照组、乌鸡人参口服液组、供试品高、中、低剂量组，每14只分为一组，共5组。各组小鼠每天按0.2 mL/10g体重灌胃给予相应样品液，阴性对照组给予等量纯净水，1次/d，连续30 d。SRBC免疫小鼠：给药25 d后，取脱纤维的羊血，生理盐水洗涤3次，每次离心(2 000 r/min)10 min，压积SRBC用生理盐水配成体积分数为2%的细胞悬液，每只小鼠注射0.2 mL。SRBC免疫小鼠4 d后(d30)，末次给药1 h，颈椎脱臼处死，去脾脏进行抗体生成细胞检测。将脾脏碾碎，用Hank’s 液配成细胞悬液，过200目筛网，并将细胞浓度调整为3.0×106个/mL。培养基(1 g琼脂糖加双蒸水定容到100 mL)加热溶解于50 ℃保温，与等量pH 7.2～7.4 Hank’s液混合，取混合液0.5 mL，加入50 μL体积分数为10%的SRBC(用SA缓冲液配置)，20 μL批细胞悬液，混匀后倾倒与琼脂糖薄层片上，待琼脂凝固后，放入CO2培养箱中孵育1～1.5 h，加入SA缓冲液稀释的补体(1∶8)，温育1～1.5 h后，计算溶血空斑数。

1.4.4.3 远东拟沙丁鱼低聚肽对正常小鼠单核-巨噬细胞功能的影响

参考侯虎[16]的方法，稍作改动。

取BALB/c雄性小鼠70只，按体重随机分为阴性对照组、乌鸡人参口服液组、供试品高、中、低剂量组，每14只分为一组，共5组。各组小鼠每天按0.2 mL/10 g体重灌胃给予相应样品液，阴性对照组给予等量纯净水，1次/d，连续30 d。末次给药满1 h，按10 mL/kg体重从尾部静脉注射稀释的印度墨汁[V(25%印度墨汁)∶V(生理盐水)=1∶3]。注入墨汁后2 min和10 min，分别从眼眶静脉丛采血20 μL，加入2 mL 0.1% Na2CO3溶液中，以Na2CO3溶液作空白对照，于600 nm波长处测定OD值，计算吞噬指数a，并测定脾脏指数、肝脏指数和胸腺指数。

(1)

(2)

式中：t1表示墨水注射后2 min的时间;t2表示墨水注射后10 min的时间；OD1表示墨水注射后2 min样品的OD值；OD2表示墨水注射后10 min样品的OD值。

1.4.4.4 远东拟沙丁鱼低聚肽对正常小鼠NK细胞活性的影响

参考侯虎[16]的方法，稍作改动。

取BALB/c雄性小鼠70只，按体重随机分为阴性对照组、乌鸡人参口服液组、供试品高、中、低剂量组，每14只分为一组，共5组。各组小鼠每天按0.2 mL/10g体重灌胃给予相应样品液，阴性对照组给予等量纯净水，1次/d，连续30 d。

脾细胞悬液制备：末次给药1 h，解剖小鼠取出胸腺、脾脏，计算脏器系数。将脾脏碾碎，用Hank’s 液配成单细胞悬液，过200目筛网，弃上清液将细胞浆加入0.5 mL灭菌水20 s，红细胞裂解后加入8 mL Hank’s 液，于1 000 r/min离心10 min，用1 mL RPMI 1640完全培养液重悬，用体积分数为1%冰醋酸稀释后染色计活细胞数，调整细胞浓度为2×107个/mL。

自然杀伤细胞(natural killer cell, NK细胞)活性检测：取靶细胞和效应细胞各100 μL(效靶比50∶1)，加入U型96孔培养板中；靶细胞自然释放孔加靶细胞和培养液各100 μL，靶细胞最大释放孔加靶细胞和25 g/L Triton各100 μL；设置3个平行，与37 ℃，体积分数5% CO2培养箱中培养4 h，然后将96孔培养板于1 500 r/min离心5 min，每孔吸取上清100 μL置平底96孔培养板中，同时加入LDH基质液100 μL，室温反应5 min，每孔加入1 mol/L的HCl溶液30 μL，在酶标仪490 nm处测定光密度值(OD)。

(3)

式中：OD0表示靶细胞自然释放孔的OD值；OD1表示靶细胞最大释放孔的OD值；OD2表示反应后样品的OD值。

1.5 数据分析

实验数据用平均值±标准偏差(n=13)表示，使用 JMP 10.0和 Excel 2013 软件进行数据处理和显著性分析。

2 结果与讨论

2.1 远东拟沙丁鱼低聚肽基本分子质量分布

近些年，国内外的研究发现，从海洋生物中提取的肽类具有良好的生物活性，其活性成分主要集中在3 000 u以下[17-18]。不同来源的活性肽其分子质量不同，而不同分子质量的肽也表现不同的生物活性[10,19]。QIAN等[20]从乳酸杆菌发酵液中提取多肽，研究发现当肽的分子质量为3 000～5 000 u 时，其抗氧化活性比较高。STUKNYTE等[21]报道，从牛乳乳酸菌发酵液中分离得到多肽，分子质量小于3 000 u的组分能显降低Caco32细胞中NF-kB因子的活性，具有免疫调节的作用。由表1可知，远东拟沙丁鱼低聚肽中分子质量在1 000 u以下的组分，占比为96.57%。其中分子质量1 000～500 u的组分比例为16.74%，分子质量500～180 u的组分比例为52.39 %，分子质量小于180 u的组分比例为27.44%。分子质量500～180 u的组分占比为最大，其数均分子质量和重均分子质量分别为257 u和282 u。

表1 远东拟沙丁鱼低聚肽分子量分布Table 1 Distribution of SSO weight

注：“/”表示未检出。

2.2 远东拟沙丁鱼低聚肽氨基酸含量

表2 远东拟沙丁鱼低聚肽粉中氨基酸的含量Table 2 The contents of amino acids in SSO

2.3 远东拟沙丁鱼低聚肽营养成分与微量成分的含量

远东拟沙丁鱼低聚肽中营养成分与微量成分结果如表3。样品中的主要成分为蛋白质，占总干重的91.1%，能量为1 548 kJ/100g，低聚肽含量为66.4 g/100g，灰分含量为4.8 g/100g。硒是人体所必须的微量元素，《中国居民膳食营养素参考摄入量》中规定成人推荐摄入量为50 μg/d，而国际营养科学会推荐富硒食品中硒含量为0.04～0.15 mg/100g[25]。低聚肽中硒的含量很高，为1.66 mg/100g，可以作为人体摄入硒元素的良好来源。其他常见的金属元素和有害成分的含量，其比例小于1%。

表3 远东拟沙丁鱼低聚肽中营养成分与微量元素的含量Table 3 The contents of nutrients and trace elements in SSO

2.4 远东拟沙丁鱼低聚肽增强免疫力功能评价

2.4.1 远东拟沙丁鱼低聚肽对正常小鼠ConA诱导脾淋巴细胞转化的影响

ConA诱导脾淋巴细胞转化试验结果如表4所示，与阴性对照组相比，乌鸡人参口服液组小鼠脾淋巴细胞转化OD值显著性升高(p<0.05)；样品高剂量组小鼠的淋巴细胞转化OD值显著性增加(p<0.05)；而样品中、低剂量组小鼠的淋巴细胞转化OD值与阴性对照组相比没有显著性差异(p>0.05)，这呈现一种剂效关系。结果证明：乌鸡人参口服液、沙丁鱼低聚肽3个剂量对小鼠抗体生成细胞的测定为阳性，能增强小鼠脾淋巴细胞增殖能力。

表4 远东拟沙丁鱼低聚肽对正常小鼠脾淋巴细胞增殖率的影响Table 4 Effects of SSO on proliferation rate oflymphocytes in normal mice

注：*表示与阴性对照组相比有显著性差异p<0.05。

脾脏是机体内最大的外周免疫器官，也是淋巴细胞接受抗原刺激和产生免疫应答的重要场所，在机体的免疫调节、免疫防御和免疫修复中都有着重要的作用。脾淋巴细胞在收到抗原物质刺激后能分化增殖、发生特异性免疫应答，是机体中最重要的免疫效应细胞，因此淋巴细胞的增殖能力是反应机体细胞免疫的重要指标[26]。据报道，有研究人员发现面筋蛋白酶解物[27]、玉米胚芽蛋白酶解物[28]中提取的肽类，与沙丁鱼低聚肽的作用类似，可以显著提高小鼠脾淋巴细胞增殖能力，这证明沙丁鱼低聚肽具有增强淋巴细胞增殖的能力。

2.4.2 远东拟沙丁鱼低聚肽对正常小鼠体液免疫功能的影响

在补体的参与下，SRBC与致敏动物血清中的溶血素产生溶血反应。血清中溶血素的含量可以通过溶血过程中的血红蛋白来检测，因此血清溶血素是代表机体体液免疫的重要指标[29]。远东拟沙丁鱼低聚肽对小鼠体液免疫功能的影响结果如表5所示，乌鸡人参口服液，样品低、中、高剂量组小鼠的脾脏指数均高于阴性对照组，但各组间的胸腺指数、脾脏指数均无显著性差异(p>0.05)。与阴性对照组相比，乌鸡人参口服液小鼠的空斑数极显著性升高(p<0.05)，样品3个剂量组小鼠的空斑数均显著性增加(p<0.05)。结果表明，乌鸡人参口服液，沙丁鱼低聚肽3个剂量对正常小鼠体液免疫功能结果为阳性。

表5 远东拟沙丁鱼低聚肽粉对正常小鼠体液免疫功能的影响Table 5 Effects of SSO on humoral immune function in normal mice

注：*表示与阴性对照组相比有显著性差异,p<0.05。

2.4.3 远东拟沙丁鱼低聚肽对正常小鼠单核-巨噬细胞功能的影响

单核-巨噬细胞既是效应细胞，又是免疫调节细胞。吞噬活性是巨噬细胞的一个重要特性。异体抗原侵入机体时，会引起巨噬细胞聚集并吞噬，反映了机体非特异性免疫功能[29]。远东拟沙丁鱼低聚肽对小鼠单核-巨噬细胞功能的影响结果如表6，各小组之间的胸腺指数、脾脏指数和肝脏系数均无统计学差异(p>0.05)，而各组之间的吞噬指数也无显著性差异(p>0.05)。结果表明，乌鸡人参口服液、沙丁鱼低聚肽对小鼠单核-巨噬细胞功能无显著影响。沙丁鱼低聚肽对单核-巨噬细胞功能增强不显著，这可能与远东拟沙丁鱼蛋白的氨基酸组成有关。研究表明不同来源的食源性蛋白活性肽，因氨基酸组成、结构和理化性质的不同，其生物活性功能也各不相同[3]。

表6 远东拟沙丁鱼低聚肽粉对正常小鼠单核-巨噬细胞功能的影响Table 6 Effects of SSO on mononuclear-macrophage function in normal mice

2.4.4 远东拟沙丁鱼低聚肽对正常小鼠NK细胞活性的影响

自然杀伤细胞(NK细胞)是一种具有异质性功能的免疫细胞，是与特异性免疫应答无关的自然杀伤细胞[29]。NK细胞对机体内淋巴细胞有调节作用，其对异体抗原的杀伤作用不需要预先免疫或者致敏，是机体抗肿瘤的第一道防线。NK细胞在机体抗肿瘤及免疫调节活动中有着重要意义，其活性是检验免疫功能的重要指标[30]。傅炜昕等[31]研究发现，凝胶过滤层析分离得到低分子地龙活性肽(分子质量8 000～20 000)具有较强的增强免疫功能，可以提高NK细胞的杀伤率，并与IL-2具有协同作用。刘仁杰[32]报道，通过林蛙油提取小分子活性肽，通过小鼠NK细胞活性试验发现，中剂量组[300 mg/(kg·d]即可显著增强NK细胞活性。远东拟沙丁鱼低聚肽对小鼠NK细胞活性的影响结果如表7所示，与阴性对照组相比，乌鸡人参参照组小鼠的NK细胞活性显著性升高(p<0.05)，样品高剂量组小鼠的NK细胞活性显著性增加(p<0.05)；而样品中、低剂量组小鼠的NK细胞活性与阴性对照组相比无显著性差异(p>0.05)。结果表明，乌鸡人参口服液、沙丁鱼低聚肽高剂量能显著增强小鼠NK细胞活性。

注：*表示与阴性对照组相比有显著性差异,p<0.05。

3 结论

远东拟沙丁鱼低聚肽分子质量主要在1 000 u以下，富含谷氨酸、赖氨酸、天冬氨酸、亮氨酸、硒等成分，具有增强正常小鼠免疫力的功能。远东拟沙丁鱼低聚肽可以作为增强免疫力保健食品的配料，具有广阔的发展前景，而产品标准和生产技术在其产业化过程中尚待建立和不断完善。