一种检测猪伪狂犬病野毒方法的建立

马 良,许 磊,李晓冉

(1.中牧实业股份有限公司,北京 丰台 100070;2.农业部兽用生物制品与化学药品重点实验室,北京 海淀 100095)

猪伪狂犬病是由伪狂犬病病毒(Pseudorabies virus,PRV)引起猪的一种急性传染病,临床表现为母猪的繁殖障碍,保育猪呼吸道症状,哺乳仔猪发热、神经症状等。PCR方法是猪伪狂犬病病原诊断的重要技术手段,通常采用国家标准《GB/T 18641-2002伪狂犬病诊断技术》中PCR方法。然而,国家标准方法仅针对gD基因进行扩增,未考虑gE基因缺失活疫苗免疫动物后携带疫苗毒的问题,从而难以判断动物是否因野毒感染而发病。为此,在伪狂犬病基因缺失活疫苗广泛免疫的情况下,伪狂犬病病原检测需要充分考虑疫苗gE基因缺失的情况,是部分缺失(如HB2000株),还是完全缺失(如Bartha-K61株),据此设计合适引物加以鉴别。本研究目的即是建立一种可以有效鉴别不同疫苗毒株和野毒的方法,为猪伪狂犬病野毒感染检测提供可靠的方法。

1 材料与方法

1.1 病毒及疫苗 猪伪狂犬病病毒Ea株(PRVEa,经典株)、猪伪狂犬病病毒HNzy2014株(PRVHNzy2014,流行毒株)、猪瘟病毒C株(CSFV)、猪繁殖与呼吸综合征病毒JXA1-R株(PRRSV)、猪流行性腹泻病毒(PEDV)、猪传染性胃肠炎病毒(TGEV)、日本乙型脑炎病毒(JEV)、猪细小病病毒(PPV)、猪圆环病毒2型(PCV-2)、由本实验保存,猪伪狂犬病病毒活疫苗(Bartha-K61株),猪伪狂犬病耐热保护剂活疫苗(HB2000株),购买于市场。

1.2 生化试剂 病毒核酸提取试剂盒EasyPure®Viral DNA/TNA kit、反转录试剂 TransScript®First-Stand cDNA kit、PCR试剂EasyTaq®PCR SuperMix等试剂,均购自北京全式金生物技术有限公司。

1.3 伪狂犬病野毒检测 根据NCBI发表参考毒株序列及疫苗株基因序列,选择猪伪狂犬病疫苗毒株gE缺失区域设计引物1对,上游引物gE1:5′-GACCATGCGGCCCTTTCTGCT-3′,下游引物 gE2:5′-GCCCTCGGACACGTTCACCAG-3′。 PCR 反应体系为:2 × EasyTaq®PCR SuperMix 25 μL,上、下游引物(10 pmol/L)各1μL,DNA/cDNA 1 μL,加纯水至50 μL。PCR反应条件:94℃ 3 min,94℃30 s,65℃ 30 s,72℃30 s,72℃5 min,步骤2至步骤4循环30次,PCR产物进行凝胶电泳观察,PRV野毒阳性样本应出现277 bp大小的核酸条带。

1.4 鉴别检验 选取 PRV-Ea、PRV-HNzy 2 014、Bartha-K61、HB2 000等4个伪狂犬病毒株,提取病毒核酸,分别采用1.3所述的伪狂犬病野毒gE-PCR和GB/T 18 641-2 002两种方法进行检测,比较两种方法对野毒和疫苗毒的鉴别检测能力。

1.5 特异性试验 选择猪的常见病毒性传染病病原提取DNA或cDNA,采用1.3所述方法进行PCR检测,确定方法的特异性。 CSFV、PRRSV、JEV、TGEV、PEDV等病毒提取RNA,采用TransScript®First-Stand cDNA kit进行反转录,获得病毒cDNA,PPV、PCV-2、PRV等病毒提取DNA,作为PCR反应的模板。

1.6 敏感性试验 构建含有gE目标片段的T克隆载体,提取纯化质粒,采用NanoVue Plus超微量分光光度计测定质粒浓度,换算为拷贝数,以TE溶液稀释成101～108个拷贝,采用1.3的PCR方法进行检测,以出现阳性条带最低拷贝数作为方法的最低检测限。

1.7 组织样品检测 PRV-HNzy2014野毒感染猪、猪伪狂犬耐热保护剂活疫苗(HB2000株)接种猪各5头,接种后5 d,采集脑组织和肺组织,按照1∶10比例与PBS混合,研磨匀浆,6 000 r/min离心10 min,收集上清,采用EasyPure®Viral DNA/RNA kit提取DNA,按照1.3所述方法检测病原核酸。

2 结果

2.1 鉴别检验 分别采用1.3所属的伪狂犬病野毒gE-PCR检测方法和GB/T 18641-2002方法进行4种伪狂犬病病毒的检测,其中建立的野毒检测方法仅能扩增出经典和流行PRV野毒,对Bartha-K61、HB2000、疫苗株扩增为阴性,说明该方法可以有效区分疫苗毒和野毒,而GB/T 18 641-2 002方法无法实现野毒和疫苗毒的鉴别(见图1、图2)。

图1 GB/T 18 641-2 002引物鉴别检验

图2 gE引物鉴别检验

2.2 特异性试验 以 CSFV、PRRSV、JEV、TGEV、PEDV病毒cDNA,PPV、PCV-2病毒DNA为模板,经伪狂病犬野毒gE-PCR检测方法检测均无目的条带,仅PRV-Ea可以扩增出大小为277 bp的目标条带(见图3),说明本方法检测其他常见猪源病毒为阴性,特异性较好。

图3 特异性检验

2.3 敏感性试验 构建了含有目标gE片段的T克隆质粒,初始浓度为101 μg/mL,相当于2.2×1010个拷贝/μL。以 TE溶液稀释成10～108个拷贝/μL,采用伪狂犬病野毒gE-PCR检测进行检测,结果高于等于103个拷贝的核酸可以扩增出阳性条带,低于10～102拷贝数核酸未能检出,因此方法的最低检测限为103个拷贝。

图4 敏感性检验

2.4 组织样品检测 采用伪狂犬病野毒gE-PCR检测方法,分别对PRV HNzy2014野毒感染猪和伪狂犬病gE基因缺失疫苗免疫猪的肺脏和脑组织混合液进行检测,结果野毒感染动物组织为核酸检测阳性,而疫苗接种动物为阴性,说明建立的方法可以较好的进行组织样品的检测(见图5)。

图5 PRV野毒感染及疫苗免疫动物组织样品检测

3 讨论

猪伪狂犬病的诊断标准GB/T 18 641-2002,自颁布以来沿用至今,由于其无法区分疫苗毒和野毒,造成检测结果存在争议。近年来,针对伪狂犬病毒gE基因的野毒检测方法已有文献[1-2]和公开专利报道[3-7],但由于猪伪狂犬病病毒富含GC核苷酸,引物设计较为困难,多数研究者将引物设计在gE中、后段,对部分gE前段缺失的疫苗(如HB 2000株)理论上依然能扩增出条带,造成假阳性结果,引起不必要的争端。

Bartha-K61是一株免疫原性良好的自然缺失疫苗株,应用较为广泛,缺失部分gI和全部gE基因,而毒力基因TK未缺失,具有一定的毒力。HB 2000株疫苗是新一代人工缺失的伪狂犬病缺失疫苗,缺失毒力TK基因,安全性较高,其gI基因的322～1 101位和gE基因的1～362位碱基存在缺失,由于其gE基因起始密码子和启动子的缺失,不会表达gE蛋白,因此接种动物血清gE抗体为阴性,可以实现与野毒感染动物血清学上的鉴别检验。本研究充分考虑了两个疫苗毒株的缺失特点,在gI中后段和gE前段设计引物,筛选出一对较为理想的引物,上游引物位于gE基因起始密码子附近,下游引物设位于gE基因上段253-273 bp位置,并建立PCR检测方法。试验表明,该方法特异性好,敏感性较高。特别值得关注的是,建立的PCR方法,所用试剂不需要添加额外GC Enhancer、DMSO等辅助试剂,即可有效扩增,同时采用了商品化含有核酸染料的PCRmix,简化了操作步骤。另外,针对人工感染动物进行了肺脏和脑组织的检测,结果感染动物均检出阳性结果,未出现组织核酸的非特异扩增干扰杂带,因此该方法适合于进行组织样品猪伪狂犬病病原野毒的检测,有一定的推广应用价值。

参考文献:

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