雾化吸入甘草酸减轻博莱霉素所致小鼠肺纤维化的机制研究*

李俸敏，王火，曹波，王宁

（1.重庆市九龙坡区中医院，重庆 400039；2.中国人民武装警察部队后勤学院附属医院，天津 300162；3.中国人民武装警察部队后勤学院，天津 300309；4.四川大学华西医院再生医学研究中心，四川 成都 610041）

肺纤维化（pulmonary fibrosis，PF）是由多种因素引起的弥漫性间质性肺疾病，其主要病理特征是弥漫性肺泡炎、成纤维细胞增殖以及细胞外基质的过度沉积[1-3]，进而引起进行性肺功能下降，最终可诱发呼吸衰竭而致死亡[4]。甘草酸（glycyrrhizic acid，GA）是从传统中药光果甘草中提取的天然化合物，具有抗炎、抗氧化、抗肿瘤、抗菌及抗病毒等广泛的药物特性[5]。前期研究发现，一定剂量的GA具有抗肺纤维化的作用，但是其有效剂量较大（灌胃剂量为250 mg/kg）。结合GA具有药物特性及雾化能快速作用于靶器官等优点，本研究采用GA雾化吸入并与GA灌胃比较，研究其抗肺纤维化作用及可能的机制。

1 材料与方法

1.1 实验动物

SPF级雄性昆明小鼠90只，体重18～20 g，购自军事医学科学院实验动物研究中心。小鼠适应性喂养5 d，食物和纯净水可自由摄取。

1.2 药品、试剂及主要仪器

GA（陕西富捷药业有限公司，批号：20140605），博莱霉素（日本化药珠式会社，生产批号：650472），吸入用布地奈德悬液（普米克令舒）（澳大利亚Astra Zeneca Pty Ltd公司，产品批号：LOT 318406），欧姆龙（Omron）超声雾化器NB-150U[乐道克电子制造（南通）有限公司]，羟脯氨酸检测试剂盒（碱）（南京建成生物工程研究所，批号：20160701），小鼠IL-6、TGF-β1酶联免疫吸附试验（ELISA）试剂盒购自上海拜力生物科技有限公司，羊抗兔IgG购自中彬金桥生物技术有限公司，羊抗鼠IgG（H+L）、兔抗IL-6、兔抗IL-17A抗体购自美国Proteintech公司，鼠抗β-actin、兔抗p-Smad2购自武汉博士德生物工程有限公司，兔抗TGF-β1购自美国Affbiotech公司。

1.3 方法

1.3.1 分组 SPF级雄性昆明小鼠90只随机分成6组：对照组、模型组、GA250灌胃（intragastric administration，IA）组、GA12组、GA24组及布地奈德雾化（atomizing inhalation，AI）组，每组15只。

1.3.2 复制肺纤维化模型及给药 模型组及各给药组分别给予5 mg/kg的博莱霉素溶液气管滴注，复制小鼠肺纤维化模型。24 h后IA组按250 mg/kg剂量以GA溶液灌胃，GA12和GA24组分别给予12和24 mg/ml剂量的GA溶液4 ml雾化吸入；AI组雾化吸入0.25 mg/ml的布地奈德混悬液4 ml；对照组和模型组分别雾化等量的生理盐水。各组每天雾化1次，连续21 d。第7、14和21天每组随机处死5只小鼠。小鼠眼球取血，3 000 r/min离心20 min后取上清，-80℃冷冻保存；颈椎离断处死后，取右肺上叶，4%中性甲醛固定，包埋、切片，其余组织-80℃冷冻保存。

1.3.3 HE染色和Masson染色 小鼠肺组织切片作HE染色和Masson染色。镜下（×200）观察并评价肺组织炎症及纤维化程度。

1.3.4 HYP含量检测 小鼠肺组织匀浆后，羟脯氨酸检测试剂盒检测HYP含量以明确肺组织中胶原水平，具体方法依照说明书进行操作。

1.3.5 IL-6含量检测 ELISA法测定小鼠血清中IL-6含量，检测炎症因子，具体方法依照说明书进行。

1.3.6 Western blot检测 小鼠肺组织中IL-6、IL-17A、p-Smad2及TGF-β1蛋白表达水平均经Western blot检测。

1.4 统计学方法

数据分析采用Graphpad Prism 5统计软件，计量资料以均数±标准差（±s）表示，多组比较采用单因素方差分析，检验方差齐性，两组间比较采用t检验，P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 小鼠肺组织HE染色及炎症评分比较

雾化第7天，模型组小鼠肺组织出现大量炎症细胞浸润，肺泡间隔充血、增厚，肺泡腔变窄。模型组与对照组炎症评分比较，采用t检验，差异有统计学意义（t=16.04，P=0.000），模型组炎症评分高于对照组；GA12组、GA24组及IA组与模型组炎症评分比较，采用单因素方差分析，差异无统计学意义（P＞0.05）；AI组与模型组炎症评分比较，差异有统计学意义（F=3.477，P=0.009），AI组炎症评分低于模型组（见图1、3）。第14天，模型组炎症评分高于对照组（t=14.23，P=0.000）；各治疗组与模型组炎症评分比较，可见GA24组炎症评分低于IA和AI组（F=3.063，P=0.018）（见图1、4）。第21天，模型组炎症评分高于对照组（t=11.14，P=0.000）；各给药组与模型组炎症评分比较，差异无统计学意义（见图1、5）。

图1 雾化第7、14和21天炎症评分

图2 雾化第7、14和21天纤维化评分

2.2 小鼠肺组织Masson染色及纤维化评分比较

图3 雾化第7天肺组织切片 （HE染色）

雾化第7和14天，模型组逐渐出现蓝染的胶原纤维。模型组与对照组纤维化评分比较，采用t检验，差异有统计学意义（7 d：t=2.828，P=0.047；14 d：t=4.243，P=0.013），模型组纤维化评分均高于对照组；各给药组与模型组纤维化评分比较，经单因素方差分析，差异无统计学意义（见图2、6、7）。第21天，模型组可见大量增生的胶原纤维，纤维化评分高于对照组（t=7.000，P=0.020）；各给药组与模型组比较，可见GA24组胶原纤维减少，纤维化评分降低，差异无统计学意义（见图2、8）。

2.3 小鼠肺组织HYP含量比较

雾化第7天，模型组与对照组HYP含量比较，采用t检验，差异有统计学意义（t=13.270，P=0.006），模型组HYP含量高于对照组；各给药组与模型组比较，差异无统计学意义（P＞0.05）。第14和21天，模型组HYP含量均高于对照组（14 d：t=13.040，P=0.006；21 d：t=7.005，P=0.020）；各给药组与模型组比较，GA12和GA24组可见MDA含量降低，且第21天时GA12及GA24组HYP含量低于IA组和AI组（14 d：F=12.030，P=0.009；21 d：F=24.750，P=0.002）。见图 9。

图4 雾化第14天肺组织切片 （HE染色）

图5 雾化第21天肺组织切片 （HE染色）

2.4 小鼠血清IL-6含量比较

雾化第7天，模型组与对照组IL-6含量比较，采用t检验，差异有统计学意义（t=4.642，P=0.043），模型组小鼠血清IL-6含量高于对照组；各给药组与模型组比较，GA24组IL-6含量降低，且低于IA组和AI组（F=6.839，P=0.018）。第14和21天，模型组IL-6含量高于对照组；各给药组与模型组比较IL-6含量也有降低，差异无统计学意义（P＞0.05）。见图10。

2.5 小鼠肺组织中IL-6、IL-17A、p-Smad2及TGF-β1蛋白表达水平

Western blot结果显示（见图11～15）：雾化第7天，模型组与对照组IL-6的表达水平比较，采用t检验，差异有统计学意义（t=5.290，P=0.034），模型组IL-6的表达水平高于对照组；各给药组与模型组IL-6的表达水平比较，采用单因素方差分析，差异有统计学意义（F=10.52，P=0.006），GA24组IL-6的表达水平降低，且低于其余各组。第14天，模型组IL-6的表达水平高于对照组（t=4.972，P=0.008）；各给药组与模型组比较，可见GA24组IL-6的表达水平降低，且低于IA组和AI组（F=12.95，P=0.000）。第21天，模型组IL-6的表达水平高于对照组（t=5.107，P=0.007），而各组间差异无统计学意义（P＞0.05）。见图13。

图6 雾化第7天肺组织切片（Masson染色）

图7 雾化第14天肺组织切片 （Masson染色）

第7天时，模型组与对照组IL-17A的表达水平比较，采用t检验，差异有统计学意义（t=5.294，P=0.006），模型组IL-17A表达水平高于对照组；各给药组与模型组IL-17A的表达水平比较，采用单因素方差分析，差异无统计学意义（P＞0.05）。第14天，模型组IL-17A表达水平高于对照组（t=8.549，P=0.001）；各给药组与模型组比较，采用单因素方差分析，差异无统计学意义（P＞0.05）。第21天，模型组IL-17A表达水平高于对照组（t=5.377，P=0.006）；各给药组与模型组比较，可见GA24组IL-17A表达水平降低，且低于其余各组（F=5.492，P=0.007）。见图14。

雾化第7天，模型组与对照组p-Smad2的表达水平比较，采用t检验，差异无统计学意义（P＞0.05）。第14天，模型组p-Smad2的表达高于对照组（t=6.427，P=0.003）；各给药组与模型组p-Smad2的表达水平比较，经单因素方差分析，差异有统计学意义（F=25.160，P=0.000），GA24组p-Smad2的表达水平低于其余各组。第21天，模型组p-Smad2的表达高于对照组（t=3.855，P=0.018）；各给药组与模型组比较，GA12和GA24两组p-Smad2的表达均有降低，差异无统计学意义（P＞0.05）。见图 14。

图8 雾化第21天肺组织切片 （Masson染色）

图9 肺组织HYP含量比较

图10 血清IL-6含量比较

第7和14天时，模型组与对照组TGF-β1的表达水平比较，采用t检验，差异无统计学意义（P＞0.05）。第21天，模型组与对照组TGF-β1的表达水平比较，采用t检验，差异有统计学意义（t=13.080，P=0.000），模型组TGF-β1的表达水平高于对照组；各给药组与模型组TGF-β1的表达水平比较，采用单因素方差分析，差异有统计学意义（F=86.250，P=0.000），GA24组TGF-β1表达水平降低，且低于IA组和AI组。见图15。

图11 小鼠肺组织中IL-6、IL-17A、p-Smad2及TGF-β1蛋白表达水平

图12 肺组织IL-6表达水平

图13 肺组织IL-17A表达水平

图14 肺组织p-Smad2表达水平

图15 肺组织TGF-β1表达水平

3 讨论

目前，临床治疗肺纤维化仍以激素和免疫抑制剂联合应用为主，临床疗效欠佳且伴不同程度的不良反应[6-7]。近年来，从中草药中寻找有效的治疗药物成为肺纤维化研究的热点。GA具有抗炎、抗氧化、抗肿瘤、抗菌及抗病毒等广泛的药物特性，在实验研究中已发现其具有抗肺纤维化作用。根据最新《雾化吸入疗法在呼吸疾病中的应用专家共识》[8]，雾化吸入治疗呼吸系统疾病具有起效迅速、疗效佳、全身不良反应少等多种优势，是治疗呼吸系统相关疾病较理想的给药方法。因此，结合GA具有的药物特性及雾化能快速作用于靶器官等优点，本研究采用GA雾化吸入并与GA灌胃相比较，研究其抗肺纤维化作用及可能的机制。

实验结果表明，正常肺组织肺泡上皮完整，肺泡腔内少有炎症细胞浸润，未见肺间质增宽，少有蓝染的胶原纤维。雾化第7天，模型组肺组织HE染色可见肺组织结构严重破坏，大量炎症细胞浸润；Masson染色可见肺间质逐渐增宽，开始出现蓝染胶原纤维。第14天，模型组肺泡腔内炎症细胞浸润有所减轻，肺间质增宽，蓝染的胶原纤维增多。而与模型组比较，GA12和GA24两组抑制肺间质的增宽，蓝染的胶原纤维也有减少，而胶原表达的标志物HYP含量也逐渐增加。第21天，模型组病理切片可见肺间质较宽，胶原纤维大量增多，HYP表达量达到顶峰。雾化GA12和GA24两组与模型组相比胶原面积减少，且GA24组的抗纤维化效果优于IA组和AI组。

IL-17是由Th17细胞产生的一种重要的促炎症细胞因子，参与并介导多种炎症反应和自身免疫性疾病的发生和发展[9-10]。IL-6作为常见的炎症因子，在纤维结缔组织和平滑肌增生过程中发挥重要作用[11]。研究发现，IL-17和IL-6都是引起肺纤维化的关键促炎介质，与TGF-β1/Smads通路密切相关。IL-6和IL-17表达上调，尤其是IL-17表达上调时，可整体上调TGF-β1/Smads通路的表达。本研究发现，IL-6在复制模型后第7天升高后逐渐降低，而IL-17的表达逐步升高，与其相对应TGF-β1、p-Smad2表达也逐步升高。GA12和GA24组降低IL-17、TGF-β1及p-Smad2水平，优于IA组及AI组。IA初期不能减轻炎症反应，后期可逐渐减轻纤维化。而AI组第7天时能抑制IL-6的表达且效果优于GA组，说明其可抑制早期的炎症反应，而对纤维化长期变化无显著改善。因此可推测，雾化吸入GA初期可降低IL-6水平以减轻小鼠的炎症反应，然后通过抑制IL-17、p-Smad2及TGF-β1表达减轻纤维化程度，从而改善博莱霉素所致小鼠肺纤维化，其效果优于GA250灌胃；而布地奈德也可降低IL-6和IL-17水平，其减轻炎症疗效与GA24相当，但后期并未抑制p-Smad2和TGF-β1表达，可能并不通过TGF-β1/Smads通路发挥作用。

综上所诉，GA雾化吸入可通过抑制肺纤维化中TGF-β/Smads通路的表达来抑制博莱霉素所致小鼠的肺纤维化。雾化吸入GA具有应用于肺纤维化临床治疗的价值。

参 考 文 献：

[1] STRIETER R M, MEHRAD B. New mechanisms of pulmonary fi brosis[J]. Chest, 2009, 136(5): 1364-1370.

[2] BARKAUSKAS C E, NOBLE P W. Cellular mechanisms of tissue fi brosis 7. New insights into the cellular mechanisms of pulmonary fi brosis[J]. Am J Physiol Cell Physiol, 2014, 306(11): C987-996.

[3] FERNANDEZ I E, EICKELBERG O. New cellular and molecular mechanisms of lung injury and fibrosis in idiopathic pulmonary fi brosis[J]. Lancet, 2012, 380(9842): 680-688.

[4] 相炜宏, 王立锋, 苗运博. 博莱霉素诱导小鼠肺纤维化模型的差异基因表达谱分析[J]. 中国呼吸与危重监护杂志, 2015, 14(3):242-249.

[5] PLOEGER B, MENSINGA T, SIPS A, et al. The pharmacokinetics of glycyrrhizic acid evaluated by physiologically based pharmacokinetic modeling[J]. Drug Metab, Rev, 2001, 33(2): 33125-33147.

[6] COTTIN V, CRESTANI B, VALEYRE D, et al. Diagnosis and manage-ment of idiopathic pulmonary fibrosis: french practical guidelines[J]. Eur ResPir Rev, 2014, 23(132): 193-214.

[7] 郭刚, 王久存, 史颖, 等. 参麦开肺散对NIH/3T3成纤维细胞增殖及胶原合成的影响[J]. 解放军医药杂志, 2015, 27(2): 24-28.

[8] 中华医学会呼吸病学分会《雾化吸入疗法在呼吸疾病中的应用专家共识》专家制定组[J]. 中华医学杂志, 2016, 96(34): 2696-2708.

[9] SHABGAH A G, FATTAHI E, SHAHNEH F Z. Interleukin-17 in humaninflammatory diseases[J]. Advances in Dermatology &Alergology, 2014, 31(4): 256-261.

[10] WEI J, CHEN D. IL-17 cytokines in immunity and inflammation[J].Emerg Microbes Infect, 2013, 2(9): e60.

[11] LE T T, KARMOUTY-QUINTANA H, MELICOFF E, et al.Blockade of IL-6 Trans signaling attenuates pulmonary fi brosis[J].J Immunol, 2014, 193(7): 3755-3768.