BQ-123对蛛网膜下腔出血大鼠神经功能的保护作用研究*

赵雅宁，李建民，孙竹梅，赵旭，郭向飞，薛承景

（1.华北理工大学 护理与康复学院，河北 唐山 063210；2.华北理工大学附属医院，河北 唐山 063000）

近年的统计发现我国蛛网膜下腔出血（subarachnoid hemorrhage，SAH）的发病率为1‰，死亡率高达30%。除此之外，约有60%以上的患者疑有认知功能缺失及精神障碍等后遗症，严重影响患者生存质量及再就业[1]。目前，临床治疗中高度重视早期神经保护剂的应用，以防治SAH造成的神经缺陷。BQ-123是由5个氨基酸组成的五环肽，是内皮素受体（endothelin receptor A，ETA）拮抗剂，可降低血管痉挛、抑制交感神经系统及肾素-血管紧张素系统活性，目前已初步证实对SAH有一定的保护作用[2]，但具体机制尚不明确。研究显示，SAH导致神经功能缺陷的关键是脑损伤后细胞正常的稳态环境受到破坏，某些信号转导系统发生紊乱，导致神经细胞死亡[1-3]。自噬是溶酶体对自身结构进行吞噬降解的过程。研究发现自噬广泛存在于正常的生理病理过程中，该过程包括细胞废物清除、结构重建、生长分化、营养缺乏和肿瘤发生等[4]。雷帕霉素靶蛋白（mammalian target of rapamycin，mTOR）是丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶，其激活后通过磷酸化其下游的靶蛋白，进而影响细胞自噬进程，在中枢神经系统疾病中发挥重要作用[5]。但BQ-123对SAH神经功能损伤的保护作用是否与mTOR-自噬通路的活化有关，目前报道甚少。本研究复制大鼠SAH模型，应用mTOR特异抑制剂雷帕霉素和不同剂量BQ-123进行干预，观察其对海马区磷酸化mTOR、自噬关键因子Beclin-1和微管相关蛋白1（轻链LC3）-Ⅱ（两者是自噬过程中特异因子，可折射出自噬发生、发展的程度）以及大鼠神经功能的影响，以探讨BQ-123对SAH的治疗机制。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

1.1.1 实验动物 清洁级雄性SD大鼠160只，体重350～450 g[购置于北京维通利华实验动物技术有限公司，合格证号SCXK（京）2009-003]。随机分为假手术组（Sham组）、蛛网膜下腔出血组（SAH组）、雷帕霉素组、BQ-123低剂量组和BQ-123高剂量组，每组32只。每组分为6、24、72及144 h 4个时间亚组。

1.1.2 主要试剂 Anti-mTOR、Anti-Beclin1、Anti-LC3-Ⅱ（兔抗大鼠）（北京博奥森公司），mTOR、Beclin-1、LC3引物（生工生物工程上海股份有限公司），实时逆转录聚合酶链反应（real-time reverse transcription-polymerase chain reaction，real-time RTPCR）试剂盒（大连宝生物公司），免疫组织化学二抗试剂盒pv6001（北京中杉金桥公司）。

1.2 仪器与设备

Nikon摄影生物光学显微镜（日本Nikon公司），5417R冷冻离心机（德国Eppendorf公司），ZH-CSC型穿梭箱及抓力测试仪（安徽正华生物仪器设备有限公司），眼科镊、眼科剪、无菌线及缝合针等（上海手术器械厂）。

1.3 方法

1.3.1 动物模型复制 参考文献[6]，采用经典的自体血2次枕大池注血法（间隔48 h分别向枕大池注射自体动脉血0.3 ml）复制大鼠SAH模型。Sham组向枕大池2次注入0.3 ml生理盐水，余操作均与SAH组一致。雷帕霉素组：复制模型前30 min侧脑室注射，剂量为5 μl（10 nmol）/只。BQ-123高、低剂量组：在复制模型前30 min尾静脉注射BQ-123（将BQ-123用生理盐水按10 μg/ml稀释，低剂量组每次给予50 μg/kg、高剂量组每次给予75 μg/kg），然后再复制SAH模型。48 h后重复给药1次。

1.3.2 模型复制成功判定标准 当行2次枕大池注血时，可见少量血性脑脊液在穿刺部位渗出，该现象充分说明穿刺针位置准确；剥离脑部时肉眼可见极其显眼的血性液体散在分布脑底基底池部位。模型复制过程中，SAH组死亡7只，1只模型不符合标准被剔除；雷帕霉素组死亡8只，BQ-123低剂量组死亡4只，BQ-123高剂量组死亡2只。上述被剔除动物依次补齐，最终纳入统计学分析：Sham组、SAH组、雷帕霉素组、BQ-123 低剂量组和BQ-123高剂量组，每组32只大鼠。

1.3.3 神经功能评测 学习能力评测：每组各时间取4只大鼠，参考文献[7]，采用ZH-CSC型穿梭实验视频分析系统（shuttle box system，SBS）分别测定动物行为学能力。每只大鼠被电击30次，记录被动回避潜伏期（passive avoidance latency，PAL）和主动回避反应次数，主动回避反应次数占总训练次数的百分比即为主动回避反应率（active avoidance reaction rate，AARR）。AARR越高，PAL越短，表明动物学习能力越强。抓力实验：每组各时间点取4只大鼠，将大鼠放置于抓力测试仪上恰当位置，用脚踩下踏板将显示器读数归零，用手拉住鼠尾向后下方施加轻微力量，待大鼠握紧抓力杆时，继续增加力道，直至大鼠肢体无法抵抗外力且听到“滴”的响声时，记录数值为本次拉力值。每只大鼠行3次测试，大鼠中间需休息5 min，取平均值作为最终结果。上述各组各时间完成动物神经功能评测后，分别处死，进行病理学及RT-PCR检测。

1.3.4 脑组织皮质区形态结构观察 每组各时间取4只大鼠，4%多聚甲醛灌注固定后，取脑，截取视交叉平面至大脑横裂脑组织。石蜡包埋、冠状切片，片厚5 μm，HE染色。光学显微镜下观察。在有测微尺的光学显微镜（×400）下观察海马CA1区神经元形态变化并计数该视野下的存活神经元数量（有明显细胞膜、细胞核和核仁为存活神经细胞）。具体方法：每只动物取5张海马区切片，每张切片选取5个不重复的视野，所以每组都是100个视野，选用Motic 6.0图像采集以及分析系统计算每个视野存活的神经元数，以CA1区每个视野下平均存活细胞数量表示。

1.3.5 免疫组织化学法检测mTOR、Beclin-1和LC3-Ⅱ的表达 标本采集同HE染色，切片常规脱蜡至去离子水，滴加复合消化液后入37℃温箱孵育20 min，经PBS洗涤3次，每次5 min，入3%过氧化氢封闭内源性过氧化物酶15 min，经PBS洗涤后滴加兔抗鼠mTOR、Beclin-1和LC3-Ⅱ多克隆抗体（1∶300，1∶250，1∶250），4℃过夜；37℃复温45 min，PBS洗涤后滴加生物素化二抗，37℃ 40 min，PBS洗涤；DAB显色，苏木精轻度复染，脱水透明，封片。镜下观察并摄片。

1.3.6 real time RT-PCR检测mTOR、Beclin-1及LC3 mRNA表达 各组各时间点取4只大鼠，致死后迅速取双侧海马区组织，称量0.6 g，加入1 ml RNAiso Plus溶液后匀浆，室温静置5 min后12 000 r/min 4℃离心5 min，取上清液移至新的1.5 ml离心管内，加入1/5 RNAiso Plus溶液体积的氯仿，震荡混匀后室温静置5 min，12 000 r/min 4℃离心15 min，将上清液转移至新离心管中，加入0.5～1.0倍RNAiso Plus溶液体积的异丙醇，室温静置10 min，12 000 r/min 4℃离心10 min，弃掉上清液，用与RNAiso Plus溶液等量的75%乙醇清晰沉淀，7 500 r/min 4℃离心5 min，弃上清保留沉淀，干燥（不可加热），溶解于30 μl DEPC处理水中，测量OD260/280值，根据OD260计算RNA浓度，置入-80℃冰箱冷冻保存。

1.3.7 检测步骤 m-TOR引物：正向5'-GGTGGACG AGCTCTTTGTCA-3'，反向5'-AGGAGCCCTAACACT CGGAT-3'；Beclin-1 引物：正向 5'-CTCTCGTCAAGGC GTCACTTC-3'，反向 5'-CCTTAGACCCCTCCATTCCTC A-3；LC3引物：正向5'-ACCCTCTACGATGCTGGTG A-3'， 反 向 5'-GCTGTCCTCAATGTCCTTCTG-3'。 进 行real time One Step RT-PCR反应：反应条件为95℃预变性10 min后，95℃ 5 s，60℃ 31 s进行30个循环，72℃ 延伸10 min。将所扩增的PCR产物进行熔解曲线分析。用Gen Amp 5700 SDS Software分析结果及PCR扩增产物生成曲线。以内参GAPDH mRNA CT值标化mTOR、Becline-1和LC3 mRNA的Ct值，得到相对Ct值，具体采用2-△△Ct法（△Ct=目的基因平均Ct值‐管家基因平均Ct值，△△Ct=实验组△Ct‐对照组△Ct，相对表达量=2-△△Ct）进行计算。

1.4 统计学方法

数据分析采用SPSS 17.0统计软件，计量资料以均数±标准差（±s）表示，组间比较采用单因素方差分析，两两比较采用SNK-q检验，P＜0.05差异有统计学意义。

2 结果

2.1 组织病理学检测结果

采用单因素方差分析，结果显示，各组大鼠海马区存活神经细胞数量比较，差异有统计学意义（P＜0.05）；与Sham组比较，SAH组术后各时间存活神经细胞数降低（P＜0.05）；与SAH组比较，雷帕霉素组、低和高剂量BQ-123组术后各时间点存活神经细胞数增加（P＜0.05）；高剂量BQ-123组术后各时间点存活神经细胞数量高于低剂量BQ-123组（P＜0.05）（见表1）。Sham组，海马区神经细胞排列整齐、细胞形态结构正常，神经元胞体较大，胞核大而圆，核仁清晰；SAH组，海马区可见神经细胞变性水肿，细胞轮廓模糊，亦可见死亡神经细胞，表现为细胞出现核溶解、核碎裂或核消失结构不清；雷帕霉素组神经元结构损伤减轻，大部分细胞排列整齐、细胞结构完整；低和高剂量BQ-123组各时间点神经细胞形态结构减轻，视野中结构完整神经细胞增多，在高剂量BQ-123组变化尤为明显（见图1）。

2.2 神经功能检测结果

2.2.1 穿梭实验结果 采用单因素方差分析，结果显示各组大鼠不同时间AARR和PAL比较，差异有统计学意义（P＜0.05）；与Sham组比较，SAH组大鼠对刺激反应迟钝，动物的AARR减少、PAL延长（P＜0.05）；与SAH组比较，雷帕霉素组、低和高剂量BQ-123组大鼠对刺激反应灵敏，动物的AARR增多、PAL缩短（P＜0.05），上述变化在高剂量BQ-123组最为明显。见表2、3。

表1 各组大鼠不同时间海马区存活神经细胞数量比较 （个/高倍视野，±s）

表1 各组大鼠不同时间海马区存活神经细胞数量比较 （个/高倍视野，±s）

注：1）与Sham组比较，P ＜0.05；2）与SAH组比较，P ＜0.05；3）与低剂量BQ-123组比较，P ＜0.05

组别 6 h 24 h 72 h 144 h Sham 组 188.65±20.90 189.8±19.85 190.10±20.05 189.80±19.90 SAH 组 120.65±16.501） 93.00±12.651） 72.60±10.801） 80.75±9.801）雷帕霉素组 140.56±15.302） 122.8±14.252） 98.36±15.202） 110.72±10.552）低剂量BQ-123组 132.45±18.452） 110.80±16.452） 84.25±12.602） 92.20±10.252）高剂量 BQ-123 组 152.80±19.70 2）3） 130.75±17.50 2）3） 136.90±18.752）3） 134.80±16.80 2）3）F值 204.797 225.012 240.014 133.630 P值 0.000 0.000 0.000 0.000

图1 各组大鼠24 h海马CA1区神经细胞形态 （HE染色×400）

表2 各组大鼠不同时间AARR比较 （%，±s）

表2 各组大鼠不同时间AARR比较 （%，±s）

注：1）与Sham组比较，P ＜0.05；2）与SAH组比较，P ＜0.05；3）与低剂量BQ-123组比较，P ＜0.05

组别 6 h 24 h 72 h 144 h Sham 组 73.67±1.63 74.17±2.14 75.67±1.86 76.83±1.72 SAH 组 40.33±1.631） 48.17±2.321） 53.00±1.551） 59.17±2.041）雷帕霉素组 44.05±1.342） 51.95±1.962） 56.45±1.682） 64.38±2.042）低剂量BQ-123组 43.78±1.292） 52.53±1.832） 55.13±1.522） 64.27±2.162）高剂量 BQ-123组 45.83±1.722）3） 55.12±1.472）3） 60.17±2.142）3） 65.67±2.252）3）F值 122.422 152.477 92.428 95.288 P值 0.000 0.000 0.000 0.000

2.2.2 抓力实验结果 采用单因素方差分析，结果显示各组大鼠不同时间的抓力实验拉力值比较，差异有统计学意义（P＜0.05）；与Sham组比较，SAH组各时间抓力测定分值显著降低，其中6 h拉力值最低（P＜0.05）；与SAH组比较，雷帕霉素组、低和高剂量BQ-123组大鼠各时间点分值均有所升高（P＜0.05）；上述变化在高剂量BQ-123组最为明显。见表4。

表3 各组大鼠不同时间PAL比较 （s，±s）

表3 各组大鼠不同时间PAL比较 （s，±s）

注：1）与Sham组比较，P ＜0.05；2）与SAH组比较，P ＜0.05；3）与低剂量BQ-123组比较，P ＜0.05

组别 6 h 24 h 72 h 144 h Sham 组 16.33±1.21 16.67±1.03 16.67±1.21 17.33±0.82 SAH组 50.83±1.471） 40.17±1.601） 34.17±1.721） 28.33±1.501）雷帕霉素组 47.56±1.672） 36.85±1.352） 30.23±1.662） 23.96±1.522）低剂量BQ-123组 48.12±1.552） 37.50±1.522） 29.83±1.602） 24.83±1.382）高剂量 BQ-123组 46.00±1.412）3） 35.83±1.172）3） 27.67±1.372）3） 20.83±1.472）3）F值 44.492 83.102 105.428 97.955 P值 0.000 0.000 0.000 0.000

2.3 各组大鼠mTOR、Beclin-1、LC3-II阳性表达比较

mTOR、Beclin-1、LC3-Ⅱ阳性表达主要位于细胞核，阳性细胞的胞核可见细小的棕黄色颗粒。Sham组可见少量mTOR、Beclin-1、LC3-Ⅱ阳性细胞，染色棕黄。与Sham组比较，SAH组各时间的磷酸化mTOR、Beclin-1、LC3-Ⅱ免疫阳性反应增强；与SAH组比较，雷帕霉素组mTOR免疫阳性反应降低，Beclin-1、LC3-Ⅱ免疫阳性反应增高；与SAH组比较，BQ-123干预组mTOR免疫阳性反应降低，Beclin-1、LC3-Ⅱ免疫阳性反应进一步增强。见图2。

表4 各组大鼠不同时间的抓力实验拉力值比较 （±s）

表4 各组大鼠不同时间的抓力实验拉力值比较 （±s）

注：1）与Sham组比较，P ＜0.05；2）与SAH组比较，P ＜0.05；3）与低剂量BQ-123组比较，P ＜0.05

组别 6 h 24 h 72 h 144 h Sham 组 2 000.53±0.26 2 000.40±0.21 2 000.43±0.29 2 000.47±0.22 SAH 组 776.93±18.311） 1 110.17±16.301） 1 333.57±11.201） 1 435.48±15.531）雷帕霉素组 905.30±16.262） 1 253.36±18.252） 1 495.62±12.652） 1 598.20±12.452）低剂量BQ-123组 916.07±15.192） 1 224.02±20.182） 1 421.47±11.502） 1 511.02±36.102）高剂量 BQ-123组 1 077.08±30.842）3） 1 439.02±13.412）3） 1 612.43±13.652）3） 1 717.95±13.162）3）F值 267.764 588.619 823.885 224.161 P值 0.000 0.000 0.000 0.000

2.4 各组大鼠mTOR、Beclin-1、LC3 mRNA表达比较

由表5～7可见，采用单因素方差分析，结果显示各组大鼠海马区mTOR、Beclin-1及LC3 mRNA表达水平比较，差异有统计学意义（P＜0.05）；与Sham组比较，SAH组各时间mTOR、Beclin-1及LC3 mRNA表达水平增高，其中mTOR mRNA 24 h达高峰，持续至72 h仍有较高水平表达，而Beclin-1、LC3 mRNA表达水平于24 h达高峰后，72 h迅速下降，但仍高于Sham组（P＜0.05）；与SAH组比较，雷帕霉素组各时间点mTOR mRNA表达降低，Beclin-1和LC3 mRNA表达水平增高（P＜0.05）；与SAH组比较，BQ-123干预组各时间mTOR mRNA表达水平降低、Beclin-1和LC3 mRNA表达水平增高（P＜0.05），且Beclin-1和LC3 mRNA高表达持续至72 h。

图2 各组大鼠24 h海马CA1区mTOR、Beclin-1和LC3-Ⅱ表达 （免疫组织化学法×400）

表5 各组大鼠海马区mTOR的mRNA相对表达量比较 （±s）

表5 各组大鼠海马区mTOR的mRNA相对表达量比较 （±s）

注：1）与Sham组比较，P ＜0.05；2）与SAH组比较，P ＜0.05；3）与低剂量BQ-123组比较，P ＜0.05

组别 6 h 24 h 72 h 144 h Sham 组 1.000±0.000 1.000±0.000 1.000±0.000 1.000±0.000 SAH 组 1.847±0.0041） 2.375±0.0061） 2.156±0.0041） 1.536±0.0041）雷帕霉素组 1.232±0.0022） 1.426±0.0032） 1.319±0.0022） 1.117±0.0022）BQ-123低剂量组 1.698±0.0042） 1.924±0.0052） 1.628±0.0032） 1.310±0.0032）BQ-123 高剂量组 1.446±0.0032）3） 1.430±0.0042）3） 1.235±0.0022）3） 1.124±0.0022）3）F值 41.840 44.502 38.551 44.842 P值 0.000 0.000 0.000 0.000

表6 各组大鼠海马区Beclin-1的mRNA相对表达量比较 （±s）

表6 各组大鼠海马区Beclin-1的mRNA相对表达量比较 （±s）

注：1）与Sham组比较，P ＜0.05；2）与SAH组比较，P ＜0.05；3）与低剂量BQ-123组比较，P ＜0.05

组别 6 h 24 h 72 h 144 h Sham 组 1.000±0.000 1.000±0.000 1.000±0.000 1.000±0.000 SAH 组 1.063±0.0021） 1.160±0.0021） 1.024±0.0021） 1.024±0.0021）雷帕霉素组 1.411±0.0022） 1.526±0.0022） 1.519±0.0012） 1.207±0.0022）BQ-123低剂量组 1.124±0.0042） 1.362±0.0062） 1.356±0.0042） 1.124±0.0032）BQ-123 高剂量组 1.447±0.0022）3） 1.671±0.0052）3） 1.706±0.0062）3） 1.286±0.0042）3）F值 121.642 125.643 107.433 47.048 P值 0.000 0.000 0.000 0.000

表7 各组大鼠海马区LC3 mRNA相对表达量比较 （±s）

表7 各组大鼠海马区LC3 mRNA相对表达量比较 （±s）

注：1）与Sham组比较，P ＜0.05；2）与SAH组比较，P ＜0.05；3）与低剂量BQ-123组比较，P ＜0.05

组别 6 h 24 h 72 h 144 h Sham 组 1.000±0.000 1.000±0.000 1.000±0.000 1.000±0.000 SAH 组 1.329±0.0041） 1.692±0.0101） 1.146±0.0121） 1.018±0.0041）雷帕霉素组 1.655±0.0082） 2.428±0.0092） 2.173±0.0382） 1.344±0.0032）BQ-123低剂量组 1.444±0.0042） 1.892±0.0102） 1.728±0.0122） 1.186±0.0042）BQ-123 高剂量组 1.737±0.0102）3） 2.319±0.0122）3） 2.296±0.0152）3） 1.452±0.0132）3）F值 67.342 132.586 72.740 38.389 P值 0.000 0.000 0.000 0.000

3 讨论

本实验中组织病理学和动物行为学结果显示，BQ-123对SAH大鼠有较好的神经保护作用，与国外学者的研究结果基本一致[8-9]。BQ-123是特异性内皮素受体ETA阻断剂，可以直接阻断ETA活性而对ETB受体几乎无作用，具有高特异性、高亲和力和水溶的特点。药理学研究显示BQ-123可抑制血管的痉挛，改善脑组织灌注压，保证脑组织的血供，使细胞的缺血缺氧得到相应的改善，缓解脑组织的缺血缺氧，神经细胞得到保护[10]。

目前，自噬已经成为医学研究领域的一个新热点。研究表明[4]，在帕金森病中，自噬功能的紊乱导致蛋白质出现变构或错误折叠与发病密切相关，提示自噬在神经系统疾病中的调节作用。最近有研究结果提示[11-12]，在缺血性脑卒中及脑出血动物模型中，自噬被不同程度地激活。也有文献报道自噬的相关通路在SAH后被激活，石晓勇等[13]通过复制蛛网膜下腔出血模型，应用自噬激动剂RAP干预自噬后，发现自噬相关蛋白LC3和Beclin-1的表达增高，自噬增强，同时大鼠神经功能评分好转，脑水肿指数下降，血脑屏障通透性好转。Beclin-1和LC3被认为是自噬过程的特征调控基因和蛋白，其表达水平是检测自噬高低水平的重要指标。本研究中BQ-123组Beclin-1 mRNA、LC3 mRNA不仅表达水平较SAH组增加，且两者高表达状态持续至72 h，且上述指标呈BQ-123剂量依赖式变化，说明BQ-123可以提高SAH后大鼠海马区Beclin-1、LC3的表达水平，即增强神经细胞自噬激活的程度。结合上述形态学和行为学变化特征，笔者认为在BQ-123的干预下，脑供血得到改善，细胞低氧、氧自由基及ATP耗竭等各种因素缓解[14]，使自噬过程或程度增加，丢失的神经细胞明显减少，神经功能恢复。

研究显示[15]，mTOR信号通路对于抑制细胞自噬的发生、调节细胞的生长代谢及增殖有重要作用。有学者[16]应用小鼠脑中动脉阻塞缺血性脑卒中模型，发现通过调制神经元内Akt-mTOR信号通路可使其介导的自噬水平提高，减轻小鼠缺血性卒中脑缺血损伤，提高缺血神经元存活率。在神经元氧糖剥夺（OGD）模型中，应用细胞自噬抑制剂3-MA抑制mTOR信号后，能够诱导醇母基因（SIR3）表达增加，减少OGD诱导的乳酸脱氢酶（LDH）的释放和神经元凋亡，并且通过调节AMPK-mTOR通路减轻过度自噬造成的缺血后神经元损伤[17]。本研究发现应用mTOR抑制剂雷帕霉素后，发现Beclin-1和LC3表达增多，存活神经细胞数量增多，说明SAH后海马区神经细胞自噬与mTOR信号活化有关。笔者发现与SAH组比较，BQ-123组mTOR mRNA表达降低，而Beclin-1 mRNA、LC3 mRNA表达增高，3者变化均与BQ-123剂量密切相关，说明BQ-123通过抑制mTOR活性，进而提高SAH后自噬程度，发挥神经保护作用。目前关于BQ-123调节mTOR信号活性的原因尚未明确。但研究显示BQ-123可增加组织中内源性一氧化氮含量，减轻钙离子超载、维持微环境稳定，具有对抗氧化应激及抗炎等作用[18]，该因素的变化可使mTOR上游的PI3K/Akt途径活化，可能是BQ-123提高mTOR信号活性的原因之一。

综上所述，BQ-123可减轻SAH后脑组织神经细胞的丢失，促进神经功能的恢复；同时BQ-123可部分抑制SAH后mTOR活性，提高神经细胞自噬程度。这为临床救治SAH提供了新思路，亦为BQ-123在临床的应用提供理论基础，具有重要的指导意义。

参 考 文 献：

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