大豆雄性不育系和恢复系花器特性及花蕾生化特性研究

于德彬， 李志刚， 刘 鹏， 向殿军

(内蒙古民族大学农学院，内蒙古通辽 028042)

大豆(GlycinemaxL.)富含蛋白质和异黄酮，是一种粮油兼用作物，亦可用于饲料、工业原料和药用[1]。随着经济的发展和人们生活水平的提高，居民对植物油脂和肉制品的需求逐年增多，导致我国大豆需求量逐年增加。2016年我国进口转基因大豆8 391万t，较2015年增加222万t，对外依赖度已经高达87%[2]。相反，我国大豆种植面积却在减少，主要归因于国产大豆产量低，种植效益远不如水稻、玉米等作物，以及国外转基因大豆进口冲击。提高国产大豆产量是解决这一严峻问题的重要途径之一。

杂种优势是生物界普遍存在的一种现象，已经在高粱、玉米、水稻等多种粮食作物和蔬菜中得到广泛的应用，是提高作物产量和加速植物遗传改良进程的重要途径之一。大量研究结果表明，利用大豆杂交种可提高大豆产量[3-4]。杂交豆1号是世界上第1个通过审定的大豆杂交种，由吉林省农业科学院赵丽梅等利用“三系”法选育，2年区试平均较对照增产21.9%[5]。吉林省农业科学院于2006年又选育审定了2年区试平均较对照增产22.7%的杂交豆2号新品种[6]，之后他们的杂交豆3号、杂交豆5号、吉育607、吉育609等多个大豆杂交种相继通过审定[7-10]。杂优豆1号是世界上第1个通过审定的夏大豆杂交种，由安徽省农业科学院选育，2年区试平均较对照增产15.37%[11]，之后他们又选育审定了2年区试平均较对照增产5.81%的杂优豆2号高蛋白杂交大豆品种[12]。

然而，大豆杂交种目前还没有得到大规模运用，其主要原因是受制于大豆制种技术，制种的产量低是限制大豆杂交种推广的主要因素。因此选育优良的不育系(龙骨瓣开张时间长及程度大、柱头寿命长、蜜腺引诱昆虫造访的特性等)、保持系和恢复系(花粉数量多、散粉性好、龙骨瓣开张时间长及程度大、花粉寿命长、蜜腺引诱昆虫造访的特性等)，选配高产的杂交组合，是推动大豆杂交种商业化生产的主要途径。本研究对3个大豆恢复系及8个大豆不育系的花器官形态特征进行了研究，同时对不育系和恢复系的小孢子发育过程及花蕾中保护酶活性进行了测定分析，旨在揭示大豆雄性不育系小孢子败育的细胞学机制和生化特性，为大豆雄性不育系的选育及利用、推动大豆杂交种的商业化生产提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 试验材料

试验材料为8个大豆雄性不育系和3个大豆恢复系，由吉林省农业科学院大豆研究中心提供。8个大豆雄性不育系命名为M1、M2、M3、N4、M5、M6、M7、M8；3个大豆恢复系命名为N1、N2、N3。

1.2 试验设计

大豆雄性不育系和恢复系材料于2016年春种植于内蒙古民族大学北区试验教学基地。试验地位于内蒙古通辽地区，年平均降水量361.6 mm，无霜冻期150 d，≥10 ℃活动积温3 200 ℃。试验土壤类型以黄沙土和栗沙土为主，0～20 cm 土层土壤空隙度为34%～38%、有机质含量为 5.31 g/kg、碱解氮含量为42.4 mg/kg，前茬为玉米，肥力中等。试验采用裂区设计，3个恢复系为主区，8个不育系为副区，共有3个区组，重复3次，种植在网室且相互隔离良好的9个小区，每个小区单独分离成8个地块，每个地块面积 5 m2，长5 m，宽1 m，行距0.5 m，株距0.15 m，每个小区都有网室隔离，防止花期昆虫串粉，试验面积共计450 m2，采用穴播的方式，每穴保证出苗2株，灌排水条件良好，5月21日出苗，待开花期进行人工放蜂处理。

1.3 调查与测定项目

花长、旗瓣宽、花瓣大小和龙骨瓣开张度(ODKP)调查在盛花期上午进行。从6月21日开始，每5 d从选定挂好标签的10株大豆上取1次样，采样的位置是植株生长点，每次采集20～30个大豆花芽，放入装有FAA固定液的离心管中，固定24 h以上，按陈利娜等的方法[13]制作石蜡切片，用于观察雄性不育系和恢复系的花原基、花萼原基、花瓣原基及雌雄蕊原基、雌雄蕊和花粉粒的发育结构。采集小花蕾、中花蕾和大花蕾时期的花芽样本，用于检测8个不育系与3个恢复系中过氧化物酶(POD)、超氧化物歧化酶(SOD)和过氧化氢酶(CAT)的活性以及丙二醛(MDA)含量。各指标进行3次生物学重复。抗氧化酶(POD、SOD、CAT)活性分别采用愈创木酚法[14]、氮兰四唑(NBT)光还原法[15]和紫外分光光度法[16]进行测定。MDA含量参照Hu等的方法[17]进行测定。

1.4 数据分析

利用SPSS 16.0软件统计各处理3次重复数据的平均值、各测定3次重复数据的标准差以及各指标数据间的差异显著性，利用Excel软件绘制柱形图。

2 结果与分析

2.1 大豆雄性不育系和恢复系的花芽分化

利用石蜡切片法，对不同发育阶段的大豆花芽进行解剖结构观察，综合花芽原基形态变化和花芽分化的特点，可将大豆的花芽分化过程分为5个时期，即花原基形成期、花萼原基形成期、花瓣原基及雌雄蕊原基形成期、雌雄蕊结构形成期和花粉粒形成期(图1)。在花芽分化的第1个时期，恢复系N1的花原基发育正常，但不育系M2的发育不完整，输导组织的发育进程比恢复系发展缓慢(图1-A)。在花萼原基形成期，恢复系的萼片结构发育完整，细胞排列的紧密，而不育系的萼片原基形成的细胞排列疏松(图1-B)。花瓣原基和雌雄蕊原基的形成期如图1-C所示，恢复系N1开始分化出10个花粉囊和1枚雌蕊，发育走向成熟，不育系M2的花瓣原基和雌雄蕊原基形成期的维管束细胞不够明显。在雌雄蕊结构形成期，恢复系N1的雄蕊分化成10枚，10个花粉囊里开始形成花药，雌蕊只有1枚，而不育系M2维管束细胞排列不紧密，也能够分化花药，但花粉粒形状不规则，可能是退化的花药(图1-D)。花芽分化的最后1个时期如图1-E所示，恢复系N1能继续发育，10个花粉囊里产生大小一致、饱满的圆形或椭圆形的花粉粒，且花粉粒数量比较多，不育系M2产生的花粉粒数量比较少，大小不等，形状不规则，有的花粉粒呈三角形，有的呈空瘪状，有的呈聚集成块的退化花粉。

2.2 大豆雄性不育系和恢复系花器外部形态比较

由表1可知，花长和旗瓣宽在恢复系和不育系及多重处理中均达到极显著差异水平，花瓣大小在不育系和恢复系中均达到极显著差异水平，在多重处理上没有差异。龙骨瓣开张度在不育系中达到极显著差异水平，在恢复系和多重处理上没有差异。

表1花长、旗瓣宽、花瓣大小、龙骨瓣开张度的方差分析

注：“**”表示差异极显著(P<0.01)。

由表2可知，主处理的3个恢复系中，N3的花长、旗瓣宽和花瓣面积最大，分别为8.28 mm、6.75 mm和56.04 mm2，与其他2个恢复系存在极显著差异。副处理的8个不育系中，M4的花长、旗瓣宽和花瓣面积最大，分别为9.19 mm、7.12 mm 和65.53 mm2，明显高于其他不育系；M5的龙骨瓣开张度最小，而M2的龙骨瓣开张度最大，为M7的3.05倍。

表2主处理和副处理的花长、旗瓣宽、花瓣大小及龙骨瓣开张度

注：同列数据后不同小写字母、大写字母分别表示在0.05、0.01 水平上差异显著。表3同。

裂区设计试验结果(表3)显示，N3M4处理的花长最大，达9.59 mm，是最小处理N2M8的1.48倍。N3M4处理的旗瓣宽最大，达7.66 mm，明显高于其他处理。N3M4的花瓣面积最大，达73.51 mm2，与其他处理均差异极显著。N2M5、N1M5和N3M5处理的龙骨瓣开张度都为零，而N3M2处理的龙骨瓣开张度最大，为8.38%，比N1M7高210.4%。综合花长、旗瓣宽、花瓣大小和龙骨瓣开张度的处理效应，N3M4处理最好。

2.3 超氧化物歧化酶(SOD)活性变化

大豆不同发育时期花蕾中SOD活性的测定结果(图2)显示，除不育系M7和M8外，所有不育系大、中、小花蕾的SOD活性均比3个恢复系高。恢复系N2和N3花蕾的SOD活性都随着花蕾的发育进程而逐渐上升，而恢复系N1中花蕾的SOD活性要比小花蕾和大花蕾高。不育系M2的SOD活性的最高值出现在中花蕾时期，而其余7个不育系SOD活性的最高值均出现在大花蕾时期。

表3裂区处理间花长、旗瓣宽、花瓣大小和龙骨瓣开张度

2.4 过氧化物酶(POD)活性变化

POD活性的测定结果(图3)表明，在小花蕾时期，有6个不育系(M1、M2、M3、M5、M6和M7)的POD活性显著高于3个恢复系；而在中花蕾和大花蕾时期，8个不育系的POD活性均明显高于3个恢复系。恢复系N2的POD活性随着花蕾的发育逐渐降低，恢复系N3的POD活性呈先降低后升高的趋势，而恢复系N1的POD活性呈现先升高后降低的趋势。多数不育系的POD活性随着花蕾的发育而逐渐增加，而不育系M5花蕾中POD活性则不断减弱；不育系M2和M8的POD活性在小花蕾阶段稍低，到中花蕾阶段有一定幅度上升，而在大花蕾阶段又开始下降。

2.5 过氧化氢酶(CAT)活性变化

图4结果显示，不育系M2、M4、M5、M6和M7的CAT活性随着花蕾的发育而呈现递增趋势；不育系M8的CAT活性在小花蕾和大花蕾时期较低，而在中花蕾时期较高；不育系M1和M3的CAT活性随着花蕾的发育呈现一定的规律，即在小花蕾阶段CAT活性稍高，到中花蕾阶段CAT活性稍有降低，而在大花蕾阶段CAT活性又开始增加，达到最高值。恢复系N1和N2的CAT活性随着花蕾的发育表现出先增加后下降的趋势，而恢复系N3的CAT活性最高值出现在大花蕾时期。随着花蕾的发育，所有不育系的CAT活性都明显低于3个恢复系。

2.6 丙二醛(MDA)含量变化

MDA含量的测定结果(图5)显示，在花蕾发育的各个时期，不育系的MDA含量均显著高于恢复系。3个恢复系的MDA含量均随花蕾的发育表现出增长趋势。8个不育系的MDA含量均在大花蕾时期达到最高，但其变化规律有所不同。其中，3个不育系(M1、M2和M8)的MDA含量随着花蕾的发育表现出升高趋势，其余5个不育系的MDA含量随着花蕾的发育表现出先降后升的趋势。

3 讨论与结论

玉米、油菜、高粱、水稻等作物利用风媒传粉、昆虫传粉或人工授粉中的一种或几种均实现了杂交种的大规模商业化生产。作为一种比较严格的自花授粉作物，大豆特殊的花器结构特征决定了大豆的天然异交率一般低于1%，所以无论是不育系的选育及繁殖，还是杂交种的生产，其效率都比较低。大豆花数量较多，但是花器较小，附着的花粉少而黏重，另外花朵开放时，柱头和花药被龙骨瓣和翼瓣紧紧包住而不外露，大面积异花间通过风媒传粉和人工授粉是难以实现的。目前大豆杂交种的制备主要通过昆虫(苜蓿切叶蜂、蓟马等)进行传粉[5，18]，所以对杂交种生产的气候条件较为苛刻。良好的环境条件能使大豆花开放度较高，散粉性能好，分泌花蜜多，传粉昆虫活跃。内蒙古通辽地区年平均降水量361.6 mm，年蒸发量1 705.6 mm，属半干旱大陆性季风气候[19]，大豆开花期少雨，且耕地有良好的地下水灌溉条件，所以较适合大豆杂交种的生产。在该环境下，恢复系中，N3的花长、旗瓣宽和花瓣面积最大，可达8.28 mm、6.75 mm和56.04 mm2；不育系中，M4的花长、旗瓣宽和花瓣面积最大，可达9.19 mm、7.12 mm 和65.53 mm2。

参考文献：

[1]郝东旭，胡景辉. 转基因技术及在大豆中的应用研究[J]. 华北农学报，2013，28(增刊1)：41-44.

[2]钱云开，高 飞，王海洋，等. 16种转基因大豆品系的实时荧光PCR法筛查[J]. 中国油脂，2017，42(2)：141-145.

[3]白志元，张瑞军，雷梦林，等. 不同株系制种对大豆杂交种农艺性状的影响[J]. 山西农业科学，2016，44(8)：1055-1058，1072.

[4]王志新，郭 泰，赵丽梅，等. 大豆杂交种杂种优势分析[J]. 中国农学通报，2010，26(15)：185-189.

[5]赵丽梅，孙 寰，马春森，等. 大豆昆虫传粉研究初探[J]. 大豆科学，1999，18(1)：73-76.

[6]彭 宝，赵丽梅，王曙明，等. 杂交豆2号选育及高产制种技术研究[J]. 吉林农业科学，2008，33(2)：3-4，7.

[7]彭 宝，赵丽梅，张伟龙，等. 大豆杂交种杂交豆3号选育报告[J]. 吉林农业科学，2010，35(6)：4-5.

[8]彭 宝，张连发，张伟龙，等. 大豆杂交种杂交豆5号选育报告[J]. 吉林农业科学，2011，36(6)：7-8.

[9]彭 宝，张伟龙，张井勇，等. 杂交大豆新品种吉育607选育报告[J]. 大豆科技，2013(4)：31-33.

[10]彭 宝，张春宝，严 昊，等. 杂交大豆吉育609选育及栽培要点[J]. 大豆科技，2016(4)：29-31.

[11]张 磊，戴瓯和，黄志平，等. 杂交大豆杂优豆1号选育[J]. 大豆通报，2007(2)：14-16.

[12]黄志平，李杰坤，张 磊，等. 高蛋白杂交大豆“杂优豆2号”选育及栽培技术[J]. 安徽农业科学，2013，41(5)：2029，2133.

[13]陈利娜，薛 辉，李好先，等. 石榴花芽石蜡切片制作方法的改良[J]. 安徽农业科学，2017，45(2)：1-3，16.

[14]Jiang M，Zhang J. Effect of abscisic acid on active oxygen species，antioxidative defence system and oxidative damage in leaves of maize seedlings[J]. Plant and Cell Physiology，2001，42(11)：1265-1273.

[15]Tang W，Page M. Overexpression of the arabidopsisAtEm6 gene enhances salt tolerance in transgenic rice cell lines[J]. Plant Cell，Tissue and Organ Culture (PCTOC)，2013，114(3)：339-350.

[16]刘砚韬，王振伟，张伶俐. 过氧化氢酶活性测定的新方法[J]. 华西药学杂志，2013，28(4)：403-405.

[17]Hu T Z，Zhou N，Fu M L，et al. Characterization ofOsLEA1aand its inhibitory effect on the resistance ofE.colito diverse abiotic stresses[J]. International Journal of Biological Macromolecules，2016，91：1010-1017.

[18]丁德荣，盖钧镒. 南方地区大豆雄性不育材料的传粉昆虫媒介及其传粉异交结实程度[J]. 大豆科学，2000，19(1)：74-79.

[19]邢明华，宝乌日其其格，于宏君，等. 内蒙古通辽市干旱灾害及应对措施[J]. 畜牧与饲料科学，2016，37(10)：61-62.

[20]郑 欣，刘夏囡，郑胜男，等. 镉胁迫下超氧阴离子对水稻幼苗根系生长和生长素分布动态变化的影响[J]. 江苏农业科学，2017，45(7)：55-58.

[21]胡月芳. 淮山多糖超声辅助提取及清除超氧阴离子自由基的作用[J]. 江苏农业科学，2017，45(4)：144-146.

[22]薛兴华，司庆永，龚 宁 .外源Ca2+对金线兰抗氧化酶活性及其同工酶的影响[J]. 江苏农业科学，2016，44(4)：229-232.

[23]郑世英，王丽燕，张海英. 镉胁迫对两个大豆品种抗氧化酶活性及丙二醛含量的影响[J]. 江苏农业科学，2007(5)：53-55.

[24]刘齐元，程元强，朱肖文，等. 雄性不育烟草花蕾中SOD、POD和CAT活性研究[J]. 中国烟草学报，2011，17(5)：34-39.

[25]刘金兵，侯喜林，陈晓峰，等. 甜椒胞质雄性不育系及其保持系生化特性研究[J]. 园艺学报，2006，33(3)：629-631.

[26]刘丽华，李保国，齐国辉，等. 雄性不育板栗雄花序败育与几种酶活性及MDA含量的关系[J]. 林业科学，2007，43(4)：121-124.

[27]赵前程，耿 宵，陈雪平，等. 花椰菜雄性不育系小孢子发育过程及其POD活性[J]. 华北农学报，2002，17(2)：108-111.