多环芳烃受体介导3甲基胆蒽诱导小鼠肝脏免疫毒性的研究

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(浙江工业大学 生物工程学院，浙江 杭州 310014)

多环芳烃(Polycyclic aromatic hydrocarbon, PAHs)是半挥发性碳氢化合物，是重要的环境和食品污染物，PAHs主要来源于含碳燃料如木材、煤、柴油和烟草的不完全燃烧[1]，迄今已发现有200多种PAHs，其中有相当部分具有致癌性[2].PAHs广泛分布于环境中，并且能够直接通过呼吸道、消化道和皮肤等被人体吸收，或者通过食物链在人和动物体内堆积，这大大增加了人类和野生动物暴露的潜在风险[3].PAHs具有持久性[4]，能够长时间停留在环境中，在不同的介质间相互迁移转化[5].芳香烃受体(AhR)是一种配体激活转录因子，可介导多环芳烃类化合物的毒性反应(包括致癌性).AhR的配体十分广泛，包括血红素、色氨酸和花生四烯酸等内源性配体和PAHs、多氯联苯(PCBs)和卤代二噁英等外源性配体[6].而PAHs作为芳烃受体(AhR)的外源配体，能够竞争性地结合AhR并识别其同源的DNA结合位点即外源性生物反应元件(XRE).XRE位于AhR-reponsive基因的调节区，它们的结合能够导致下游靶基因如细胞色素P450家族1亚科A成员1(cyp1a1)和细胞色素P450家族1亚科B成员1(cyp1b1)转录的激活[7-8].PAHs能够引起多种人类健康风险问题，例如癌症、基因突变和神经毒性等[9].刘红阳等[10]研究发现Pb和邻苯二甲酸二丁酯(Dibutyl phthalate，DBP)联合暴露可以诱导斑马鱼胚胎中白细胞介素-1β(IL-1β)和C3B基因表达水平上升，Lyz基因表达水平下降，说明Pb和DBP联合暴露可通过影响斑马鱼胚胎免疫相关基因的表达，对斑马鱼胚胎产生免疫毒性，虽然有这些进展，但是对描述PAHs在小鼠中引起炎症反应的机制的研究还是有限的.

3-甲基胆蒽(3-MC)属于二噁英类化合物，是高度脂溶性的环境污染物，可由土壤、水或饲料等进入食物链，有肝毒性、免疫毒性、生殖毒性和发育毒性等毒性[11].CH-223191是一种有效的特异性的芳烃受体(AhR)拮抗剂，它能有效抑制四氯二苯并-P-二噁英(Tetrachlorodibenzo-p-dioxin，TCDD)介导的核易位和AhR与DNA结合，并抑制TCDD诱导的荧光素酶活性.以前大量的研究表明，PAHs暴露可以通过激活AhR[12]介导肿瘤相关基因的表达，一些报道也显示PAHs能够诱导不同模式生物的免疫毒性，但是否与AhR的参与与介导相关仍是未知.

1 材料和方法

1.1 实验试剂

在注射之前，实验使用的3-MC(CAS号56-49-5，纯度99.9%)购自Supelco(Bellefonte，USA)并溶解于玉米油(Vako，Japan)，CH223191(CAS号301326-22-7，纯度99.9%)购自Sigma公司.

1.2 动物和实验设计

从中国国家实验动物资源中心(中国上海)购买总共126只5周龄的青春期雄性ICR小鼠.将小鼠保存在实验室动物房中(在笼子水平下用200 lux条带光照明，光周期为12 h光照/黑暗和(22±1) ℃的温度)1周，然后进行实验.将小鼠随机分配到两个独立实验.

实验13组小鼠(每组n=21)每隔1 d以0，5 mg/kg或20 mg/kg体重剂量进行腹腔注射3-MC. 然后，在1 d(1次注射)，3 d(2次注射)，7 d(4次注射)后处死各组中的7只处理的小鼠，迅速收集肝脏和血液等组织用于进一步使用.

实验2将小鼠随机分为3组(每组n=21)，这些小鼠每隔1 d接受0，5 mg/kg或20 mg/kg体重剂量的3-MC腹腔注射，同时每天接受10 mg/kg体重剂量的CH223191的腹腔注射.在1，3，7 d处理后，迅速收集肝脏、血液以及其他组织用于进一步分析.

在2个实验中，暴露期间自由饮食、饮水.麻醉后处死所有小鼠，并进行各种努力以使每个实验中的动物痛苦最小化，所有实验均根据毒理学动物使用指导原则进行.

1.3 基因表达分析

使用Trizol试剂(Takara biochemicals，Dalian，China)从小鼠肝脏中分离总RNA，并使用逆转录酶试剂盒(Toyobo，Tokyo，Japan)合成相应的cDNA.使用Eppendorf Mastercycler ep Realplex2(Wesseling-Berzdorf，Germany)进行实时定量聚合酶链反应(RT-qPCR).使用SYBR Green系统(Toyobo，Tokyo，Japan)检测GAPDH，AhR，Cyp1a1，Cyp1b1，肿瘤蛋白P53(P53)，MYC原癌基因(Cmyc)，Ras癌基因(Ras)，肿瘤坏死因子-α(TNF-α)，白细胞介素6(IL6)，IL1β和γ-干扰素(IFN-γ)的转录，上述基因引物的序列参考笔者团队以前的报道[13]，GAPDH转录物用作管家基因.PCR反应程序如下：95 ℃预变性1 min，95 ℃退火15 s，60 ℃延伸1 min共设置40个循环.在收集数据之后，分析不同处理组中每个基因的表达的相对表达量.

1.4 肝脏组织中炎症因子水平的测定

取约50 mg的肝脏组织，将组织加入适量的生理盐水捣碎，3 kr/min离心10 min取上清备用.使用相应的小鼠ELISA试剂盒(Multi sciences，China)，根据制造商的说明书进行操作，测定炎症因子TNF-α和IL1β的水平.ELISA测定在96孔微孔板中进行，并在酶标仪(Power wave XS，Bio-TEK，USA)上测量.

1.5 数据分析

通过方差分析(ANOVA)评估组间差异，随后使用SPSS 13.0软件(Chicago，USA)进行Fisher’s post-hoc检验.值表示为平均值±SEM.p<0.05的差异被认为是显著的.

2 实验结果与分析

2.1 3-MC和AhR抑制剂CH223191(CH)暴露小鼠对体重、相对肝脏重量的影响

在5，20 mg/kg体重剂量下，小鼠暴露于3-MC1，3，7 d后体重和相对肝重相比于对照组并没有显著的差异.3-MC和CH223191联合暴露1，3，7 d后，体重和相对肝重也没有表现明显差异(图1).这些数据说明短期急性3-MC暴露不会显著影响小鼠体重和相对肝重量.

A—Con；B—3-MC(5 mg/kg)；C—3-MC(20 mg/kg)；D—3-MC(5 mg/kg)+CH(10 mg/kg)；E—3-MC(20 mg/kg)+CH(10 mg/kg)图1 3-MC和CH223191暴露对小鼠体重、相对肝脏重量的影响Fig.1 Effects of 3-MC and CH223191 exposure on body weights and liver weights

2.2 3-MC和CH223191暴露对肝脏中AhR及下游基因表达的影响

PAHs毒性的产生主要是通过AhR介导的途径来诱导不同靶基因的转录，已有的研究结果显示，免疫系统已经证明可以为AhR介导的转录调节提供敏感靶标.在5和20 mg/kg剂量下，暴露于3-MC 1，3，7 d后，肝脏中AhR的mRNA水平显著的增加.同时AhR的两个主要靶基因(cyp1a1和cyp1b1)的mRNA水平也显著增加，并且在所有三个时间点，3-MC暴露激活cyp1a1和cyp1b1 mRNA水平均呈现剂量依赖性增长.CH223191是AhR特异性的拮抗剂，能够有效抑制TCDD诱导的AhR依赖性转录.此外，CH223191阻止TCDD与AhR的结合，并抑制TCDD介导的核易位和AhR的DNA结合[14].本实验中，暴露于3-MC的同时给予10 mg/kg体重剂量的CH223191处理，在1 d后AhR，cyp1a1和cyp1b1基因相比于单独的3-MC暴露并没有出现明显的差异，而在3，7 d的时候，AhR，cyp1a1和cyp1b1基因的mRNA水平虽然相比于对照组有明显的升高，但是相比于单独的3-MC暴露出现明显的下调，并且在处理3 d时表现得尤为明显(图2).说明AhR介导的转录途径在CH223191处理后受到一定抑制，研究也证明了CH223191可以阻止外源性配体与AhR的结合，抑制靶基因cyp1a1和cyp1b1的表达.数据说明3-MC作为外源配体可以激活AhR通路，而通过拮抗剂处理后，AhR通路在一定程度上受到了抑制.

图2 3-MC和CH223191暴露小鼠对肝脏中AhR调节基因mRNA表达水平的影响Fig.2 Effects of 3-MC and CH223191 exposure on mRNA levels of AhR regulates genes in the liver

2.3 3-MC和CH223191暴露对肝组织中相关癌基因表达的影响

近年来，用不同实验模型来研究环境污染物对免疫系统的影响越来越受到人们的关注[15-17].例如报道称人类直肠组织中PAHs的含量与直肠癌的发生有一定的相关性[18].苯并芘除了能够诱导胃癌和皮肤癌外，还可引起食管癌、上呼吸道癌和白血病，并可通过母体使胎儿致畸.PAHs是AhR的激动剂，其可以被内源性配体激活并且在免疫应答[19]、分化[20]和肿瘤促进中起重要作用[21].本实验中，在不同剂量的3-MC暴露组，暴露1 d后，所有癌基因的表达量相比于对照组没有显著的变化.暴露于3-MC 3，7 d后，P53和Cmyc的基因表达量出现明显的上调，Ras则没有明显的改变.实验结果也证明3-MC暴露小鼠，肝脏内部分癌症相关基因的表达量出现明显上调，3-MC暴露可能诱发肿瘤.3-MC和CH223191联合暴露3 d后，P53的基因表达量相比于单独的3-MC暴露出现明显的下调，而Cmyc，Ras的mRNA表达水平与对照组相比较没有明显的差异.联合暴露7 d后，P53基因的表达量与对照组相比有明显的升高，与单独的3-MC暴露相比则也出现了明显的下调，Cmyc和Ras基因的相对表达量与单独的3-MC暴露组相比则没有显著差异(图3).数据说明加入AhR拮抗剂处理后，一定程度上改变了3-MC诱导引起免疫毒性和诱导肿瘤的发生.

图3 3-MC和CH223191暴露小鼠对肝脏中癌症相关基因的mRNA表达水平的影响Fig.3 Effects of 3-MC and CH223191 exposure on mRNA levels of Cancer-related genes in the liver

2.4 3-MC，CH223191暴露对肝脏中炎症相关基因转录的影响

在单独的3-MC暴露组，处理1 d时炎症相关基因的mRNA水平显示有一定程度上的降低，而在3-MC和CH223191联合暴露1 d后，炎症相关基因的TNF-α，IL-6在肝脏中的mRNA水平出现明显的升高.此外，在3-MC分别暴露3，7 d后，相比于对照组TNF-α，IL-6和IL-1β都有明显的升高(图4).而在3-MC暴露组经过10 mg/kg体重剂量的CH223191处理后，相比于没有经过CH223191处理的3-MC暴露组的炎症基因的表达量则出现了显著的下调，并且这种下调在3 d的时候表现得尤为显著.数据说明，在3-MC暴露组经过AhR拮抗剂处理后，炎症基因的表达受到了明显的影响.而在本实验中也发现P53在拮抗剂处理后出现一定的下调，P53能抑制细胞因子IL-6的转录[22]，也能直接结合在PTGS2的启动子上从而抑制COX2的表达，从而影响炎症反应.大量的实验数据表明：P53与IL-6等炎症因子之间存在一定的关系，P53能够参与调控炎症和免疫应答.笔者测定了癌症相关基因P53，Cmyc，Ras的mRNA表达水平，单独的3-MC暴露3，7 d后，肝脏中P53，Cmyc的表达量都有明显的升高，与之相应的是其炎症基因TNF-α和IL-6的表达量也有一定的升高.在CH223191处理后，P53的表达量相比于单独的3-MC暴露组相比，出现了明显的下调，其炎症基因IL-6，TNF-α的表达量也随之有明显的下调(图3，4).例如，Rayanade[23]等报道在肺癌小鼠模型中，IL-6缺失加速肿瘤发生，但延迟肿瘤进展并延长存活时间，并且这些影响可以通过P53删除来减缓.总之，研究说明CH-223191有效地阻止了3-MC引起的诱导细胞AhR调节基因和P53的表达，进而影响其对免疫系统的影响，从而改变多环芳烃暴露引发的炎症发现和诱发肿瘤的可能性.

图4 3-MC和CH223191暴露小鼠对肝脏中炎症相关基因的mRNA表达水平的影响Fig.4 Effects of 3-MC and CH223191 exposure on mRNA levels of IL-6，IL-1β and IFN-γin the liver

2.5 3-MC和CH223191暴露3 d后对肝脏中炎症因子水平的影响

分别用5，20mg/kg的体重剂量3-MC暴露小鼠3 d后，肝脏中细胞因子IL-1β和TNF-α的水平明显升高，而在5，20 mg/kg的3-MC，10 mg/kg CH223191联合暴露3 d后，炎症因子的表达相比于单独的3-MC暴露都出现了明显的下调，如图5所示.

4 结 论

研究表明：3-MC暴露可以激活AhR介导的转录途径，通过增强一些细胞因子的转录水平和改变炎症反应来产生免疫毒性等，在经过AhR抑制剂CH223191处理后有效地阻止了3-MC引起的诱导细胞AhR调节基因和P53的表达，进而影响其对免疫系统的影响.AhR介导的转录途径受到抑制，3-MC诱导引起的的炎症反应和肝毒性也受到一定的抑制.尽管研究的数据还不能详细说明3-MC诱导的免疫毒性的机制，但为改善PAHs暴露引起的炎症反应提供了一定的思路.

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