分散液-液微萃取结合磁固相萃取用于增香保润剂样品中抗氧化剂的测定

刘春波， 杨光宇， 刘志华， 申钦鹏， 张凤梅， 何 沛， 蒋 薇， 唐石云， 尤俊衡， 赵 娇， 杨亚玲*

(1.云南省烟草化学重点实验室，云南中烟工业有限责任公司技术中心，云南昆明 650231；2.昆明理工大学生命科学与技术学院，云南昆明 650500)

增香保润剂是由多种香料、丙二醇及适量溶剂以及其他成分调配而成，但在生产过程中会添加一些合成酚类的抗氧化剂，用来延缓其氧化速度。我国常用的合成酚类抗氧化剂(SPAs)有叔丁基羟基茴香醚(BHA)、2,6-二叔丁基对甲酚(BHT)、没食子酸丙酯(PG)、叔丁基对苯二酚(TBHQ)等，但它们均有一定的毒性[1 - 3]。目前，对于SPAs的检测主要有电化学分析法[4]、高效液相色谱法[5]、气-质联用法[6]和液-质联用法[7]等。而用于抗氧化剂测定的前处理方法主要有固相萃取(SPE)[8]、双水相萃取(ATPE)[9]、液-液微萃取(LLME)[10]、中空纤维膜液相微萃取(HF-LPME)[11]等。分散液-液微萃取(DLLME)是由Assadi等于2006年首次提出的一种新型的样品前处理技术[12]。然而,经典的DLLME也有一些缺点，这些缺点在一定程度限制了该技术的应用。磁固相萃取(MSPE)[13]是近年发展起来的又一种新型样品前处理技术，它选用有磁性的或者可以磁化的材料作为吸附剂,直接将磁性吸附剂分散在样品溶液中,通过施加一个外部磁场便可以使吸附剂与样品溶液分离。此外,磁性吸附剂能完全的分散在样品溶液中，可提高萃取效率。

本文选用正癸酸(DA)对Fe3O4颗粒进行包覆，得到表面包覆正癸酸的磁性纳米颗粒(DA@Fe3O4MNPs)。辛醇通过涡旋作用力以微滴形式均匀分散在溶液中形成乳浊液，使目标分析物快速萃取到辛醇中。通过DA@Fe3O4MNPs表面的亲酯基团与脂肪醇(正辛醇)之间形成疏水作用力，将辛醇液滴吸附在磁性纳米粒子表面，再通过外加磁场的作用将磁性材料与样品溶液进行分离。最后与高效液相色谱仪结合，成功应用于增香保润剂样品中合成酚类抗氧化剂的定量分析。该方法简化了前处理过程,具有良好的精密度和准确度,为抗氧化剂的检测提供了更快捷、准确的检测方法。

1 实验部分

1.1 仪器与试剂

Agilent1260型高效液相色谱仪(美国，安捷伦科技有限公司)；XW-800型涡旋仪(上海汉诺仪器有限公司)；pH计(上海精科实业有限公司)；中低速离心机(上海外科器械制造厂)。

没食子酸丙酯(PG)、叔丁基对苯二酚(TBHQ)、叔丁基羟基茴香醚(BHA)和2,6-二叔丁基对甲酚(BHT)标准品(纯度≥99%，Aladdin试剂公司)；甲醇(色谱纯)；己醇、庚醇、辛醇、壬醇、癸醇均为优级纯，其他试剂均为分析纯。磁性纳米粒子(本实验室自制)。

增香保润剂样品由云南中烟工业有限责任公司技术中心提供。

1.2 标准溶液的配制

分别准确称取各抗氧化剂标准品50.0 mg，加少量甲醇溶解后，用甲醇定容至50 mL，摇匀，配制成1.0 mg/mL的混合标准储备溶液(配制时加入一定浓度的抗坏血酸，可延长储备液使用时间)，用锡箔纸包裹，置于冰箱冷藏保存。使用时，用甲醇逐级稀释成一系列相应浓度的工作液。

1.3 磁性纳米粒子的制备

取1.69 g硫酸亚铁铵，1.41 g FeCl3，溶于50 mL纯化水后，转移至三颈瓶中，机械搅拌下水浴加热至80 ℃，加入5 mL含100 mg癸酸的丙酮溶液，然后加入5 mL浓氨水，氮气保护下反应30 min。产物用水和乙醇交替洗涤，得到正癸酸包覆的磁性纳米颗粒(DA@Fe3O4MNPs)。

1.4 色谱条件

色谱柱：Agilent C18柱(150×4.6 mm，5 μm)；流动相A为甲醇，B为水(含质量分数0.5%冰乙酸)。梯度洗脱程序：0～3 min，50%A;3～4.5 min,50%～85%A;4.5～6.5 min，90%A;9 min以后，A保持在50%不变。流速为1.0 mL/min，检测波长为280 nm，柱温为30 ℃，进样量为20 μL。

1.5 样品制备

准确称取10.0 g增香保润剂样品，置于100 mL棕色容量瓶中。用50%甲醇稀释至刻度，定性滤纸过滤后，得到样品提取液，备用。

1.6 DLLME-MSPE操作步驟

DLLME-MSPE实验步骤如图1。在100 mL烧杯中，加入样品提取液50.0 mL,加入100 μL正辛醇，涡旋30 s,再加入160 mg/mL的DA@Fe3O3MNPs溶液100 μL,涡旋混匀30 s，用磁铁靠近烧杯，将DA@Fe3O3MNPs吸在烧杯底部，同时移除上清液。再向烧杯中加入200 μL 酸性乙腈涡旋解析，再次用DA@Fe3O3MNPs吸在烧杯底部，用注射器吸取解析液。解析液用0.45 μm滤膜过滤后，进行高效液相色谱分析。通过工作曲线求算抗氧化剂的萃取回收率。

2 结果与讨论

图1 DLLME-MSPE萃取方式示意图Fig.1 Schematic diagrams of DLLME-MSPE

2.1 材料的表征

2.1.1透射电镜(TEM)表征图2是Fe3O4纳米粒子被修饰前后的TEM图。由图可知， Fe3O4粒子均呈球形，包覆前(图2a)微粒粒径在16 nm左右，包覆后粒径大小在10 nm左右，且包覆后的粒子较修饰前的分散性得到改善。这是由于修饰材料正癸酸具有较长的碳链，部分微球表面可能有双层包覆甚至是多层包覆，导致粒径大小不是很均匀。实验中采用一步法合成正癸酸磁性微粒，在磁性粒子形成的同时包覆了正癸酸，由于癸酸分子层的存在而使得粒子间不能直接接触，避免了团聚体的产生，起到稳定的作用，使修饰后微粒的粒径反而有所减小。同时图2(b)显示，纳米粒子边缘的阴影表明正癸酸已包覆在磁性Fe3O4纳米粒子表面。

2.1.2傅立叶变换红外(FT-IR)光谱表征图3为DA@Fe3O4MNPs(a)和Octanol-DA@Fe3O4MNPs(b)的红外光谱图。589 cm-1是Fe-O的伸缩振动，在DA@Fe3O4MNPs中，1 632和1 626 cm-1对应于于 C=O 伸缩振动，2 924 cm-1处是C-H伸缩振动，可以说明正癸酸已经包覆到Fe3O4MNPs表面。此外图3b中还有1 521和1 413 cm-1，可能是由于DA@Fe3O4MNPs表面物理吸附辛醇中-OH 的伸缩振动而形成的。说明正辛醇已被吸附在磁性纳米粒子表面。

图3 DA@Fe3O4 MNPs (a)和正辛醇-DA@Fe3O4 MNPs (b)的傅立叶变换红外(FI-IR)光谱图Fig.3 FT-IR spectras of DA@Fe3O4 MNPs(a) and octanol-DA@Fe3O4 MNPs mixture(b)

2.1.3磁性分析采用振动样品磁强计(VSM)测得Fe3O4和DA@Fe3O4材料的磁滞回线(图4)。Fe3O4和DA@Fe3O4饱和磁化强度分别为60.50、31.7 emu/g。材料的剩余磁化强度和矫顽力很小，因而具有超顺磁性。由于样品中存在个别大粒子，可能大于样品的超顺磁临界尺寸。从而使样品具有一定的剩余磁化强度和矫顽力。此外由于DA@-Fe3O4表面有双层甚至是多层癸酸包覆，所以材料的磁性有所减弱，但样品仍表现为超顺磁性[14]。

2.2 DLLME条件的优化

2.2.1pH值的影响对于易受pH影响的化合物而言，与离子性环境中相比，在非离子环境中化合物的分配系数与萃取效率都比较高[15]。为了考察酸度对萃取的影响，在本实验中将样品的pH调到3.0～11.0范围之内。图5表明，pH在3.0～7.0范围之内所有目标化合物的回收率都未发生显著地变化，并且在pH=7.0时达到最高萃取率。然而，当溶液的pH高于7.0时，PG和TBHQ的回收率随着pH的增高而明显降低。因此，在本实验中选用pH在3.0～7.0之间进行萃取。

图4 Fe3O4和DA@Fe3O4纳米材料的磁滞回线Fig.4 The magnetic hysteresis loops of Fe3O4 and DA@Fe3O4 MNPs

图5 pH值对SPAs回收率的影响Fig.5 Effect of pH on recoveries of SPAs

2.2.2萃取剂的选择本实验考察了己醇、庚醇、正辛醇、壬醇、癸醇5种萃取剂对目标分析物的萃取效率。实验结果表明,与其它萃取剂相比,正辛醇对4种抗氧化剂都有很好的萃取能力。因此,在以下的实验过程中,以正辛醇作为萃取剂。

实验考察了萃取剂正辛醇的体积对萃取效率的影响。结果表明，正辛醇体积为100 μL时，达到最高萃取率。随着萃取剂体积的增大，有部分多余的正辛醇无法被磁性纳米子吸附，导致回收率降低；而体积较小时，对抗氧化剂萃取不完全，回收率不高。综合考虑以上情况，本实验选择100 μL的正辛醇作为萃取剂。

2.2.3萃取时间的影响在本实验中，萃取时间指的是涡旋时间，涡旋可以加快萃取达到平衡的时间，即从萃取剂加入到样品中到产生乳化现象的时间，无需加入分散剂。选取0～3 min时间范围内考察涡旋时间对萃取效果的影响。结果显示，在涡旋辅助乳化萃取中，涡旋时间超过30 s以后回收率几乎没有改变，表明在30 s内达到萃取平衡。这说明涡旋辅助加速了两相的传质过程，提高了萃取效率。因此，选取30 s为最佳萃取时间。

2.3 MSPE条件的优化

2.3.1DA@Fe3O4用量的选择配制5 mL浓度分别为10 mg/L的SPAs溶液，分别加入4～20 mg磁性纳米吸附剂，进行4种抗氧化剂的加标回收实验。结果显示，磁性纳米粒子用量为16 mg时的回收率明显优于用量为4～12 mg时，且与用量为20 mg相差不大。因此，对于SPAs浓度低于10 mg/L的增香保润样品，DA@Fe3O4吸附剂的用量为16 mg。

图6 解吸溶剂对SPAs回收率的影响Fig.6 Effect of eluting solution on recoveries of SPAs

2.3.2解吸溶剂的选择洗脱剂的种类对目标物的解吸有重要影响，因此考察了甲醇、酸性甲醇、乙腈、酸性乙腈、丙酮和酸性丙酮6种有机溶剂的解吸效果。结果如图6所示，甲醇、乙腈、丙酮对TBHQ、BHA和BHT的洗脱效果不错，但对PG的洗脱效果较差。酸性甲醇、酸性乙腈和酸性丙酮对四种抗氧化剂的解吸能力均较强，其中酸性乙腈的效果最好。所以实验选用乙酸乙腈(1∶99，V/V)作为解吸溶剂。

2.3.3解吸溶剂用量和方式的选择用0.1%的酸性乙腈洗脱2次(每次0.1 mL)，4种SPAs可完全从磁性纳米粒子上解吸下来。所以，本实验选择用酸性乙腈洗脱2次，每次 0.1 mL。在涡旋条件下，研究了解吸时间(0.5～3 min)对回收率的影响。在 1 min 时4种SPAs可完全从DA@Fe3O4上解吸下来。因此，解吸时间选择为1 min。

2.4 方法的线性范围、检出限和精密度

在优化的实验条件下，分别对 50、100、200、500、1 000 μg/L的系列浓度标准溶液进行萃取和测定。结果表明(表1)，PG、TBHQ、BHA和BHT在 50～1 000 μg/L 浓度范围内具有良好的线性关系，线性相关系数(r)在0.9976～0.9991之间。按信噪比(S/N)=3计算，4种SPAs检出限在1.5～6.8 μg/L之间。富集倍数为245～256倍。图7所示为增香保润剂样品和加标样品的色谱图。

表1 4种SPAs的线性方程、线性相关系数(r)和检出限Table 1 Linear equations,linear rangs,correlation coefficient,limits of detections(LOD) of 4 SPAs analytical features of the proposed method

2.5 方法的重现性和回收率

在实际增香保润剂样品中添加三种不同浓度的SPAs混合标准进行加标实验。分别在日内和日间做了平行实验(n=6),并计算了相对标准偏差(RSD)和目标分析物回收率。测定结果如表2所示,日内和日间RSD分别为3.7%～7.8%、6.9%～13.5%,4种SPAs的加标回收率在91.0%～98.4%之间。

图7 增香保润剂样品(a)和4种SPAs加标浓度为100 μg/L的增香保润剂样品(b)的色谱图Fig.7 Chromatograms of humectant sample(a) and sample spiked with SPAs(b) by DLLME-MSPE The spiked concentration of PG,TBHQ,BHA and BHT was 100 μg/L,respectively.

表2 方法的重现性和回收率Table 2 Reproducibility and recovery of the proposed method

3 结论

本文制备了正癸酸修饰的磁性Fe3O4纳米粒子,微粒呈球形,大小一致,粒径在10 nm左右。用微量的辛醇作为萃取剂，对增香保润剂中的4种抗氧化剂进行萃取；以制备的DA@Fe3O4为吸附剂，对含有4种合成酚类抗氧化剂进行吸附，利用纳米粒子的磁性达到快速分离。本方法克服了DLLME中萃取剂选择范围小，萃取后萃取剂不易取出的特点，利用疏水性的磁性纳米粒子收集萃取剂，加速了萃取过程并提高了萃取率，同时还扩展了DLLME的应用范围。为增香保润剂中抗氧化剂成分的检测提供了切实可行的方法，也可用于生产企业的质量控制。

参考文献：

[1] GUO L,XIE M Y,YAN A P,et al.Journal of Analytical Science(郭岚,谢明勇,鄢爱平,等.分析科学学报),2007,23(2):169.

沈侯低下头，吃了几块水果，淡淡地说：“我妈心气高，非要逼得我给她挣面子，我懒得看她哭哭啼啼，就先报个名，哄哄她。”沈侯回头看了一眼，见宿舍门锁着，笑着说：“你很清楚，我对学习没有太多热情，这四年大学我可是靠着你读完的。”

[2] GB 2760-1996.Hygienic Standards of Using Food Additives(食品添加剂使用卫生标准).

[3] LIN Y X,LIN R G,LI Z H.Technology & Development of Chemical Industry(林叶新,林润国,李忠海.化工技术与开发),2009,38(1):29.

[5] MENG L,XIE L X,SU H，et al.Flavour Fragrance Cosmetics(孟磊,谢黎霞,苏惠,等.香料香精化妆品),2014,(1):33.

[6] LI Y,LIU L,LIU Z H.Chinese Journal of Chromatography(李英,刘丽,刘志红.色谱),2003,21(2):170.

[7] LI X Y,MOU J,LIU H T,et al.Chinese Journal of Analytical Chemistry(李秀勇,牟峻,刘惠涛,等.分析化学),2008,36(3):369.

[8] XIA C.Physical Testing and Chemical Analysis Part B:Chemical Analysis(夏春.理化检验-化学分册),2010,46(12):1425.

[10] XING H Z,WANG X,CHEN X F,et al.Chinese Journal of Analytical Chemistry(邢寒竹,王霞,陈相峰,等.分析化学),2015,43(3):409.

[11] XIANG J,QI A M,MAO L Q.Journal of Instrumental Analysis(向俊,漆爱明,毛丽秋.分析测试学报),2009,28(5):560.

[12] Rezaee M,Assadi Y,Milani Hosseini,M R,et al.Journal of Chromatography A,2006,1116(1-2):1.

[13] WU K S,XU H Y，GUO L，et al.Food Science(吴科盛,许恒毅,郭亮,等.食品科学),2011,32(23):317.

[14] ZHANG J Y,ZHANG L X,SUN Y X，et al．Chemical Research and Application(张俊燕，张立新，孙益新，等．化学研究与应用)，2011,23(10):1319.

[15] Lu Q,Chen L,Lu M,et al.Journal of Agricultural & Food Chemistry,2010,58(5):2763.