马铃薯蛋白ACE抑制肽的Plastein反应修饰研究

高丹丹

马忠仁

热孜万古力·赛买提

田晓静

李明生

陈士恩

(西北民族大学生命科学与工程学院，甘肃 兰州 730124)

Plastein反应又称类蛋白反应或塑蛋白反应，是指在一定条件下，蛋白酶催化高浓度的蛋白质水解物或低聚肽的混合物，生成沉淀、触变胶体或具触变性黏稠的胶状类蛋白产物的过程[1]。一般认为Plastein反应是蛋白酶存在下蛋白质水解反应的逆反应，分为水解、浓缩和合成三步[2]。该反应的机理较为复杂，可能涉及水解反应、浓缩作用、转肽作用、物理聚集中的一种或几种[3]。Plastein反应能够产生原料蛋白质所没有的新肽段，其产物具有与原料蛋白质不同的氨基酸序列，可以去除蛋白质水解物的苦味，改善蛋白质的功能性质，提高蛋白质的营养价值，已成为食品工业研究的热点[4]。

目前采用Plastein反应修饰生物活性肽的研究较多，诸如：吴丹等[5]曾对酪蛋白进行酶水解及Plastein修饰改善其抗氧化性；杨锋等[6]曾对醋蛋水解物进行类蛋白修饰,并初步研究了产物的抗氧化活性；张强等[7]研究发现双孢蘑菇源抗氧化肽修饰产物的抗氧化活性大概是修饰前的4倍；王晗欣等[8]研究发现鹰嘴豆蛋白抗氧化肽修饰产物的还原力和羟自由基清除率都有显著提高；汪敬科等[9]采用Plastein反应在碱性蛋白酶存在条件下对酪蛋白水解物进行修饰，制备多个不同修饰程度的Plastein反应产物，修饰后其ACE抑制活性逐渐增加(增加至49%～62%)。上述研究表明，Plastein反应修饰可以显著提高某些生物活性肽的功效。但Plastein反应用于改善马铃薯蛋白源ACE抑制肽活性的研究还未见报道。因此，本研究拟以马铃薯蛋白为原料，在前期研究[10-11]的基础上，采用胰蛋白酶水解马铃薯蛋白制备ACE抑制肽，对马铃薯蛋白ACE抑制肽进行Plastein反应修饰，并对修饰的工艺条件进行研究，以期提高马铃薯蛋白ACE抑制肽的活性，为天然高效ACE抑制剂的制备提供一种新途径，为马铃薯蛋白资源的综合开发利用提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 材料与试剂

马铃薯：陇薯10号，购自兰州市物美大卖场；

马铃薯蛋白ACE抑制肽：ACE抑制率为(61.20±0.15)%，实验室自制。

胰蛋白酶：10 000 U/mg，美国Sigma-Aldrich公司；

ACE：2.0 U/mg，美国Sigma-Aldrich公司；

马尿酰-组氨酰-亮氨酸(HHL)：分析纯，美国Sigma-Aldrich公司；

十二烷基磺酸钠：分析纯，天津市光复精细化工研究所；

邻苯二甲醛：分析纯，北京索莱宝生物试剂；

甘氨酸、L-缬氨酸、L-组氨酸、L-酪氨酸、L-甲硫氨酸、L-苯丙氨酸、L-赖氨酸、亮氨酸：分析纯，上海中秦化学试剂有限公司。

1.1.2 主要仪器设备

紫外分光光度计：UV-2000型，尤尼柯(上海)仪器有限公司；

台式高速冷冻离心机：TGL-16型，湖南湘仪实验室仪器开发有限公司；

恒温磁力搅拌器：MYP11-2A型，上海梅颖浦仪器仪表制造有限公司；

鼓风干燥箱： DHG-9030型，上海一恒科学仪器有限公司；

电子天平：FA2004B 型，上海精密科学仪器有限公司；

冷冻干燥机：Megafuge 8R型，美国热电照生有限公司；

数显酸度计：PHS-3C型，杭州雷磁分析仪器厂；

超低温冰箱：DW-86L490J型，青岛海尔特种电器有限公司。

1.2 方法

1.2.1 马铃薯蛋白质的提取 马铃薯洗净削皮切丁，用一定量的0.09% NaCl溶液和0.12%的亚硫酸钠混合液在室温下浸提1 h左右，马铃薯与提取液的比值为1∶10 (g/mL)，-4 ℃，3 000 r/min离心15 min，取上清液，加入1 mol/L HCl溶液调pH 4.2左右，于磁力搅拌器上搅拌10 min，静止1 h，再于-4 ℃，3 000 r/min离心15 min，保留沉淀，置于冷冻干燥机中冻干，得到马铃薯蛋白粉[10]。

1.2.2 马铃薯蛋白ACE抑制肽的制备工艺

马铃薯蛋白悬浊液→调pH→加酶→调水浴温度37 ℃→灭酶(90 ℃水浴15 min)→离心(10 000 r/min，20 min)→取上清液→冷冻干燥[11]

1.2.3 ACE抑制率测定 将ACE底物HHL溶解于0.1 mol/L 硼酸盐缓冲液(pH值8.3，含0.2 mol/L NaCl)中配制成6 mmol/L的浓度。取100 μL的HHL与100 μL的ACE抑制剂混合，然后加入150 μL 5 U/mL的ACE溶液，37 ℃ 反应60 min。加入250 μL的HCl(1 mol/L)终止反应，再加入1.5 mL乙酸乙酯进行萃取，强烈震荡1 min，3 000 r/min 离心5 min。取酯层部分0.5 mL，在110 ℃下蒸干。继续加入3 mL氯化钠溶液(1 mol/L)溶解残渣，以1 mol/L 氯化钠溶液作参比，在228 nm下测定其吸光值记做S，用蒸馏水代替酶解肽，步骤同上，测定其吸光值记做A，用蒸馏水代替粗酶液和酶解肽液，测定其吸光值记做C[12]。按式(1)计算ACE抑制率：

(1)

式中：

N——ACE抑制率，%；

A——在反应中不加抑制剂的吸光值；

S——在反应中同时加入ACE和ACE抑制剂的吸光值；

C——ACE与HHL空白反应的吸光值。

1.2.4 单因素试验 以Plastein反应产物ACE抑制率为指标，分别研究外源氨基酸的种类、酶与底物浓度比([E]/[S])、反应温度、反应pH、反应时间对ACE抑制率的影响。

(1) 外源氨基酸的种类：称取15 g的马铃薯蛋白ACE抑制肽于试剂瓶中，加50 mL蒸馏水配制成底物浓度为30%的悬浮液，按0.5 mmol/g·多肽的比例分别加入甘氨酸、亮氨酸、酪氨酸、赖氨酸、组氨酸、缬氨酸、甲硫氨酸和苯丙氨酸，调节pH值为8.0，反应温度37 ℃，反应时间2 h，[E]/[S] 3 000 U/g，95 ℃灭酶10 min，10 000 r/min 离心5 min，取上清液，测定Plastein反应产物ACE抑制率。

(2) [E]/[S]：称取15 g的马铃薯蛋白ACE抑制肽于试剂瓶中，加50 mL蒸馏水配制成底物浓度为30%的悬浮液，按0.5 mmol/g·多肽的比例加入甘氨酸，调节pH值为8.0，反应温度37 ℃，反应时间2 h，分别控制[E]/[S]为 2 500，3 000，3 500，4 000，4 500 U/g，95 ℃灭酶10 min，10 000 r/min离心5 min，取上清液，测定Plastein反应产物ACE抑制率。

(3) 反应温度：称取15 g的马铃薯蛋白ACE抑制肽于试剂瓶中，加50 mL蒸馏水配制成底物浓度为30%的悬浮液，按0.5 mmol/g·多肽的比例加入甘氨酸，调节pH值为8.0，分别控制反应温度为32，37，42，47，52 ℃，反应时间2 h，[E]/[S] 3 500 U/g，95 ℃灭酶10 min，10 000 r/min离心5 min，取上清液，测定Plastein反应产物ACE抑制率。

(4) 反应pH：称取15 g的马铃薯蛋白ACE抑制肽于试剂瓶中，加50 mL蒸馏水配制成底物浓度为30%的悬浮液，按0.5 mmol/g·多肽的比例加入甘氨酸，分别控制pH值为7.0，7.5，8.0，8.5，9.0，反应温度42 ℃，反应时间2 h，[E]/[S] 3 500 U/g，95 ℃灭酶10 min，10 000 r/min离心5 min，取上清液，测定Plastein反应产物ACE抑制率。

(5) 反应时间：称取15 g的马铃薯蛋白ACE抑制肽于试剂瓶中，加50 mL蒸馏水配制成底物浓度为30%的悬浮液，按0.5 mmol/g·多肽的比例加入甘氨酸，调节pH值为8.0，反应温度42 ℃，分别控制反应时间为2.0，2.5，3.0，3.5，4.0 h，[E]/[S] 3 500 U/g，95 ℃灭酶10 min，10 000 r/min 离心5 min，取上清液，测定Plastein反应产物ACE抑制率。

1.2.5 响应面分析 在单因素的基础上，根据Box-Behnken的中心组合试验设计原理，以马铃薯蛋白ACE抑制肽的抑制率为响应值，选择反应温度、反应pH、[E]/[S]进行三因素三水平的响应面试验。通过响应面分析法优化Plastein反应修饰的工艺条件。

1.2.6 数据分析 采用F检验对试验数据进行方差分析来评价响应面回归模型的统计意义，采用Design-Expert V 8.0.6 软件对数据进行分析。

2 结果分析

2.1 单因素分析

2.1.1 外源氨基酸种类对马铃薯蛋白ACE抑制肽Plastein反应的影响 由图1可知，加入8种外源氨基酸之后，马铃薯蛋白ACE抑制肽修饰产物对血管紧张素转化酶均表现出一定的抑制活性。加入甘氨酸后，修饰产物的ACE抑制率最高达到了(75.1±2.12)%，L-苯丙氨酸加入后ACE抑制率最低，为(49.1±0.82)%。添加亮氨酸、L-酪氨酸、L-赖氨酸、L-组氨酸、L-缬氨酸和L-甲硫氨酸后的ACE抑制率依次为(73.70±1.24)%，(71.10±1.43)%，(67.90±0.11)%，(62.20±1.05)%，(59.30±1.04)%，(53.20±0.98)%。表明甘氨酸对马铃薯蛋白ACE抑制肽的Plastein反应修饰效果最好，故选用甘氨酸为最佳外源氨基酸。

图1 外源氨基酸种类对马铃薯蛋白ACE抑制肽的Plastein反应的影响Figure 1 The effect of extrinsic amino acid on ACE inhibitory activity

2.1.2 [E]/[S]对马铃薯蛋白ACE抑制肽Plastein反应的影响 由图2可知，随着[E]/[S]的增加，抑制率随之增大，但增加到3 500 U/g时，ACE抑制率达到最大值[(79.30±0.95)%]，继续增加加酶量，抑制率减小。随着[E]/[S]的增大，Plastein反应修饰程度达到最大，但此时修饰产物的ACE抑制率降低，可能是[E]/[S]过大，过多的蛋白酶容易催化修饰产物重新发生水解反应，促使体系中活性物质减少，进而导致其ACE抑制率降低[13]。故选择3 500 U/g 作为响应面试验的中心点。

图2 酶与底物浓度比对ACE抑制率的影响Figure 2 The effect of Enzyme/Substrate ratio on ACE inhibitory activity

2.1.3 反应温度对马铃薯蛋白ACE抑制肽Plastein反应的影响 由图3可知，ACE的抑制率会随着温度的增加呈先上升后下降的趋势。当温度为42 ℃时，ACE抑制率达到最大值[(78.95±0.42)%]。温度对ACE抑制肽抑制率的影响主要是通过影响酶的活性实现的。当温度低于42 ℃时，随着酶解温度的增大，酶促反应速度加快，ACE抑制率也逐步增大，而当温度超过42 ℃时，随着温度的升高，酶可能失活而导致抑制率下降[14]。故选择42 ℃作为响应面试验的中心点。

图3 反应温度对ACE抑制率的影响Figure 3 The effect of reaction temperature on ACE inhibitory activity

2.1.4 反应pH值对马铃薯蛋白ACE抑制肽Plastein反应的影响 由图4可知，随着pH值的增大，马铃薯蛋白ACE抑制肽修饰产物的ACE抑制率先增大后减小，pH 8.0时，修饰产物的ACE抑制率最高，达到(79.20±0.65)%。低于或高于此pH值，修饰产物的ACE抑制能力均有不同程度的减弱，可能是偏酸性或偏碱性环境会引起蛋白酶和底物蛋白发生一定程度的变性，从而使蛋白酶失去部分催化功能，底物蛋白丧失部分生物活性，进而减弱修饰产物的ACE抑制能力[15]。故选择8.0作为最佳反应pH值。

图4 反应pH值对ACE抑制率的影响Figure 4 The effect of reaction pH on ACE inhibitory activity

2.1.5 反应时间对马铃薯蛋白ACE抑制肽Plastein反应的影响 由图5可知，随着反应时间的延长，马铃薯蛋白ACE抑制肽修饰产物的ACE抑制率随之上升，但是当时间达到3.0 h时ACE抑制率达到最大值[(79.7±1.22)%]，反应时间继续延长，ACE抑制率下降。这可能是反应时间过长，修饰产物在蛋白酶的作用下又发生了水解反应，重新生成了分子质量相对较小的肽类物质，修饰程度降低[16]。故选择3.0 h 作为响应面试验的中心点。

图5 反应时间对ACE抑制率的影响Figure 5 The effect of reaction time on ACE inhibitory activity

2.2 马铃薯蛋白ACE抑制肽Plastein反应修饰响应面试验分析

2.2.1 响应面试验设计 见表1。

2.2.2 多元二次模型方程的建立与检验 通过Design-Expert V8.0.6软件对表2数据进行回归分析得到多元二次关系式：

Y=82.84+0.28A+0.27B+0.21C+0.14AB-0.14AC-0.15BC-0.43A2-1.40B2-0.98C2。

(2)

表1 响应面试验设计Table 1 Designs of Response surface experiment

表2 Box-Behnken试验设计及结果
Table 2 The design and experiment results of Box-Behnken Response surface test

序号ABCACE抑制率/%试验值预测值10．00-1．001．0080．89±0．1580．5620．000．000．0083．05±0．0582．843-1．001．000．0081．12±0．0280．8641．00-1．000．0080．63±0．0580．8950．001．001．0080．79±0．2180．7861．001．000．0081．76±0．1681．707-1．00-1．000．0080．55±0．1380．618-1．000．00-1．0080．87±0．0980．8191．000．00-1．0081．93±0．1481．66100．000．000．0082．54±0．0582．8411-1．000．001．0081．24±0．0881．51120．00-1．00-1．0079．83±0．0479．84130．000．000．0082．94±0．0982．84141．000．001．0081．72±0．2381．79150．001．00-1．0080．35±0．3480．68160．000．000．0082．86±0．1582．84170．000．000．0082．83±0．1382．84

表3 二次多项模型方差分析结果†Table 3 The variance analysis results of two multinomial models

2.2.3 响应面分析和优化 由图6可知，反应温度与反应pH值、反应温度与[E]/[S]以及pH值和[E]/[S]的交互作用对修饰产物的ACE抑制率无显著影响。当[E]/[S]固定在0水平时，随着反应pH值的升高，修饰产物的ACE抑制能力呈现出先增大后减小的趋势；随着反应温度的升高，修饰产物的ACE抑制能力逐渐增大。当pH值固定在0水平时，随着[E]/[S]的升高，修饰产物的ACE抑制能力呈现出先增大后减小的趋势；随着反应温度的升高，修饰产物的ACE抑制能力逐渐增大。当温度固定在0水平时，随着[E]/[S]的升高，修饰产物的ACE抑制能力呈现出先增大后减小的趋势，可能是由于过量的蛋白酶会引发修饰产物发生二次水解，使体系中抗氧化活性物质的数量有所减少，从而影响修饰产物的ACE抑制能力；随着反应pH值的升高，修饰产物的ACE抑制能力也呈现出先增大后减小的趋势。

图6 交互作用影响抑制率的曲面图及等高线图Figure 6 Surface chart and contour map of the interaction affect the ACE inhibitory activity

2.2.4 模型验证实验 根据Box-Behnken设计的17组试验所得的结果和二次多项回归方程，利用Design Expert V 8.0.6 软件获得了ACE抑制率最高时各个因素的最佳反应条件为：温度43.68 ℃、反应pH 8.05、反应时间3.0 h，[E]/[S] 3 565.05 U/g，在此反应条件下，经由Plastein反应修饰的马铃薯蛋白ACE抑制肽对ACF的理论抑制率为(82.913±0.958)%。

为了检验模型预测的准确性和精确性，在最适反应条件下进行修饰反应并测定产物的ACE抑制率，3组平行实验所得到的实验结果分别为82.86%，82.95%，82.85%，平均值为(82.89±0.05)%，由此可见该模型能较好地预测实际反应情况。

3 结论

采用胰蛋白酶水解马铃薯蛋白制备ACE抑制肽(ACE抑制率为61.20%±0.15%)，以ACE抑制能力为评价指标，在单因素试验的基础上采用响应面法优化了马铃薯蛋白ACE抑制肽Plastein反应修饰工艺，得最佳工艺为：以甘氨酸为处源氨基酸，温度43.68 ℃、反应体系pH 8.05、反应时间3.0 h、[E]/[S] 3 565.05 U/g，底物浓度30%、外源氨基酸比例0.5 mmol/g·多肽，在最优反应条件下，抑制率可以达到(82.89±0.05)%。本研究通过Plastein反应修饰的方法有效提高了马铃薯蛋白ACE抑制肽的降血压活性，为其作为天然高效降血压剂方面的开发提供依据，并为马铃薯资源的综合利用提供新途径。

[1] 姚玉静, 崔春, 邱礼平, 等.Plastein反应条件及其机理探讨[J].中国调味品, 2009, 34(2): 45-48.

[2] DOUCET D, GAUTHIER S F, OTTER D E, et al.Enzyme-induced gelation of extensively hydrolyzed whey proteins by alcalase: comparison with the plastein reaction and characterization of interactions[J].Journal of Agricultural & Food Chemistry, 2003, 51(20): 6 036-6 042.

[3] 赵新淮, 孙辉.类蛋白反应在食品蛋白质和活性肽研究中的应用[J].东北农业大学学报, 2011, 42(11): 1-8.

[4] 朱晓杰.海地瓜蛋白酶解物Plastein反应修饰及其ACE抑制活性研究[D].青岛: 中国海洋大学, 2012: 14-33.

[5] 吴丹, 李铁晶, 赵新淮.酪蛋白水解物的酶法修饰优化与抗氧化活性改善[J].农业机械学报, 2010, 17(1): 139-144.

[6] 杨锋, 陈锦屏, 阳显莹.醋蛋水解物的类蛋白反应及对抗氧化活性的影响[J].食品工业科技, 2012, 18(1): 152-158.

[7] 张强, 王松华, 蒋胜娟, 等.双孢蘑菇源抗氧化肽的Plastein反应修饰研究[J].科技视界, 2012, 6(17): 39-43.

[8] 王晗欣, 杜双奎, 赵艳, 等.鹰嘴豆蛋白水解物类蛋白反应修饰与抗氧化活性研究[J].中国食品学报, 2015, 15(1): 34-40.

[9] 汪敬科, 赵新准.三种氨基酸添加下酶法修饰酪蛋白水解物的ACE抑制活性[J].食品与发酵工业, 2011, 37(4): 32-26.

[10] 高丹丹, 李海霞, 祁高展.发酵马铃薯蛋白制备ACE抑制肽[J].食品科技, 2015(1): 258-262.

[11] 高丹丹, 孙青青, 郭鹏辉, 等.发酵马铃薯蛋白制备抗氧化肽[J].食品工业科技, 2015, 36(7): 159-162.

[12] 彭剑秋.ACE 抑制肽定量构效关系研究[D].上海: 上海理工大学, 2012: 5-35.

[13] 赵元晖, 李八方, 曾明湧.海地瓜蛋白水解物中ACE抑制肽的分离纯化及合成[J].高等学校化学学报, 2012, 33(2): 308-312.

[14] 沈晴晴.Plastein反应修饰海地瓜酶解物制备ACE抑制肽及其机理研究[D].青岛: 中国海洋大学, 2014: 11-22.

[15] 许金龙.酪蛋白水解物Plastein反应修饰产物降血压和抗氧化活性的研究[D].哈尔滨: 东北农业大学, 2016: 4-32.

[16] 周丽杰, 韩青, 李智博, 等.酶法制备耦合 Plastein 反应的牡蛎ACE抑制肽[J].食品科学, 2017, 38(6): 104-110.

[17] 高丹丹, 杨璐璐, 祁高展.响应面法优化蕨麻多糖的提取工艺[J].天然产物研究与开发, 2015, 27(6): 1 099-1 104.

[18] 任佳丽, 黄仁贵, 李忠海.零余子粗多糖超声波辅助提取工艺优化[J].食品与机械, 2016, 32(9): 149-153.

[19] 齐娜, 李涵, 张志宇, 等.新疆红肉苹果多酚的超声波辅助提取工艺优化[J].食品与机械, 2016, 32(9): 177-182.