RP-HPLC梯度洗脱法测定2,3-二甲基-6-氨基-2H吲哚盐酸盐中乙酸的含量

施伶俐，戴根来，郑转弟

（1.安徽新华学院 药学院，安徽 合肥 230088；2.合肥久诺医药科技有限公司，安徽 合肥 230031）

盐酸帕唑帕尼是一种新型的多靶点氨酸激酶抑制剂，对血管内皮生长因子受体（VEGFR）、血小板源性生长因子受体（PDGFR）和干细胞因子受体（c-kit）具有抗增殖作用和抗血管生成作用.该药品由葛兰素史克公司研发，2006年欧洲药品管理局（EMEA）授予孤儿药资格，2009年10月美国食品药品管理局（FDA）批准上市[1].临床主要用于多种肿瘤疾病，如肾细胞癌、卵巢癌、前列腺癌、乳腺癌和肺癌等的治疗，均有较为显著的疗效[2].

2,3-二甲基-6-氨基-2H吲哚盐酸盐为盐酸帕唑帕尼合成过程中的中间产物，尽管国内外对盐酸帕唑帕尼的合成工艺做过很多改进[3-5]，但合成该中间体产物的过程中仍需要加入冰醋酸，所以，乙酸是合成路线中会引入的杂质成分，对后期的合成反应及终产物盐酸帕唑帕尼的纯度会产生影响.控制2,3-二甲基-6-氨基-2H吲哚盐酸盐中的乙酸的含量，对终产物的质量具有重要意义，故本研究采用高效液相色谱法，建立2,3-二甲基-6-氨基-2H吲哚盐酸盐中乙酸的含量测定方法，为控制杂质含量提供一定的参考.

1 实验材料

1.1 仪器

Agilent1120高效液相色谱仪（美国安捷伦科技有限公司）；

Agilent1120紫外检测器（美国安捷伦科技有限公司）；Mettler Toledo AB135-S电子天平（德国梅特勒公司）；

JL-DT60型超声波清洗器.

1.2 试剂

乙酸对照品（含量99.8%，SIGMA公司）；

乙酸、磷酸为分析纯；甲醇为色谱纯；水为纯化水.

2 方法与结果[6]

2.1 色谱条件

TSKgel ODS-100V色谱柱（4.6×150mm，5μm）；

0.05%磷酸 - 甲醇溶液梯度洗脱：0～5min（100：0），6～15min（20：80），16～20min（100：0）；检测波长：210nm；柱温：30℃；

流速：1.0mL/min；进样量：20μL.

2.2 样品的制备

2.2.1 空白溶剂

取磷酸0.5mL，精密量取，加1000mL纯化水进行稀释，摇匀，作为空白溶剂.

2.2.2 对照品溶液

取乙酸对照品250mg，精密称定，置100mL容量瓶中，加空白溶剂稀释至刻度，摇匀，作为贮备液（2.503mg/mL）.取贮备液2.0mL，精密量取，置100mL容量瓶中加空白溶剂稀释至刻度，摇匀，作为对照品溶液（50.06μg/mL）.

2.2.3 供试品溶液

称取2,3-二甲基-6-氨基-2H吲哚盐酸盐0.10g，精密称定，置10mL容量瓶中，加空白溶剂适量超声溶解，待溶解完全后，放冷，继续加空白溶剂稀释至刻度，摇匀，作为供试品溶液.

2.2.4 混合溶液

取对照品贮备液0.2mL，精密量取，取供试品0.10g，精密称定，置10mL容量瓶中，加空白溶剂适量超声溶解，待溶解完全后，放冷，继续加空白溶剂稀释至刻度，摇匀，作为混合溶液.

2.3 专属性试验

分别精密量取空白溶剂、对照品溶液、供试品溶液、混合溶液20μL注入高效液相色谱仪进行测定.结果表明，混合溶液中乙酸与供试品分离度好，空白溶剂无干扰.

2.4 检测限和定量限试验

取乙酸对照品溶液1.0mL，精密量取，用空白溶剂溶解并稀释至适当浓度的溶液，精密量取20μL，注入高效液相色谱仪进行测定，按信噪比S/N≈3和S/N≈10定义检测限和定量限，结果乙酸检测限为0.30μg/mL、乙酸定量限为1.00μg/mL.

2.5 方法学考察

2.5.1 线性关系考察

精密量取乙酸对照品贮备液（2.503mg/mL）0.5mL、1.0mL、2.0mL、3.0mL、4.0mL 置于 100mL 容量瓶中，加空白溶剂稀释至刻度，摇匀.6份溶液分别精密量取20μL，注入高效液相液相色谱仪进行测定，以峰面积为纵坐标，乙酸浓度为横坐标，绘制标准曲线，见图1，回归分析得回归方程为

结果表明，乙酸在1.00μg/mL～100.10μg/mL浓度范围内，其浓度与峰面积呈良好的线性关系.

图1 乙酸对照品标准曲线图

2.5.2 精密度试验

取线性关系考察项下对照品溶液（50.06μg/mL），精密量取20μL注入高效液相色谱仪，重复进样6次，测定峰面积，结果RSD为0.71%，表明精密度良好.

2.5.3 重复性试验

称取同一批6份2,3-二甲基-6-氨基-2H吲哚盐酸盐供试品0.10g，精密称定，置10mL容量瓶中，加空白溶剂适量超声溶解，待溶解完全后，放冷，继续加空白溶剂稀释至刻度，摇匀，作为供试品溶液.精密量取20μL注入高效液相色谱仪进行测定.结果乙酸平均含量为0.0127%，RSD为1.16%，表明重复性良好.

2.5.4 稳定性试验

取线性关系考察项下对照品溶液（50.06μg/mL），室温放置，精密量取 20μL 分别于 0、1、2、4、8、12 小时注入高效液相色谱仪，测定峰面积，计算RSD为1.06%，表明对照品溶液稳定性良好.

2.5.5 加样回收率试验

乙酸对照品溶液制备：精密称取乙酸对照品499.9mg，分别置100mL的容量瓶中，加空白溶剂稀释至刻度，摇匀.精密量取1.0mL，置10mL容量瓶中，加空白溶剂稀释至刻度，摇匀，即得.

表1 加样回收率试验结果

称取2,3-二甲基-6-氨基-2H吲哚盐酸盐0.10g，精密称定，共称取12份，分别置10mL容量瓶中，加适量空白溶剂超声溶解，再分别精密加入0.1mL、0.5mL、1.0mL、1.5mL的乙酸对照品溶液，按重复性试验项下方法制备成供试品溶液并同法测定，计算回收率，结果见表1.

结果表明，乙酸在10%～150%浓度范围内，回收率为100.3%，RSD为0.92%，加样回收率良好.

2.5.6 耐用性试验

称取2,3-二甲基-6-氨基-2H吲哚盐酸盐0.10g，精密称定，置10mL容量瓶中，加空白溶剂适量超声溶解，待溶解完全后，加入对照品贮备液（2.503mg/mL）0.2mL，继续加空白溶剂稀释至刻度，摇匀，作为供试品溶液.在更改分析条件的情况下分别精密量取20μL注入高效液相色谱仪中，考察方法的耐用性，结果见表2.

表2 耐用性试验结果

2.7 样品测定及含量限度的确定

称取三个批次2,3-二甲基-6-氨基-2H吲哚盐酸盐各0.10g，精密称定，置10mL容量瓶中，加空白溶剂适量超声溶解，待溶解完全后，放冷，继续加空白溶剂稀释至刻度，摇匀，作为供试品溶液.

称取乙酸对照品250.0mg，精密称取，置100mL容量瓶中，加空白溶剂稀释至刻度，摇匀.精密量取2.0mL，置100mL容量瓶中，加空白溶剂稀释成每1mL含50μg的溶液作为对照品溶液.

精密量取上述溶液各20μL注入高效液相色谱仪进行测定，按外标法计算样品中乙酸的含量，试验结果见表3.

表3 样品含量测定结果

结果表明，三批供试品的百分含量接近，且均小于含量限度（0.05%），由上述结果可知2,3-二甲基-6-氨基-2H吲哚盐酸盐中乙酸的含量均符合规定.

3 讨论

本课题采用高效液相色谱法测定2,3-二甲基-6-氨基-2H吲哚盐酸盐中乙酸的含量，因为有机相可在较低压力下进行色谱分析的优点，更有利于色谱柱的使用，因此选用甲醇-水系统更为适宜.参考相关文献，选择甲醇-水系统进行2,3-二甲基-6-氨基-2H吲哚盐酸盐中乙酸的含量测定，为了使乙酸的保留时间合适，故选用了洗脱效果更好的梯度洗脱.

通过对比供试品与对照品中乙酸的含量来确定2,3-二甲基-6-氨基-2H吲哚盐酸盐中的乙酸是否符合规定.同时，为了进一步考察，进行了方法学研究，包括线性关系考察、精密度试验、稳定性试验、重现性试验、加样回收率试验、耐用性试验以及含量限度的测定等等，结果均符合要求.采用RP-HPLC法测定2,3-二甲基-6-氨基-2H吲哚盐酸盐中的乙酸含量的方法灵敏度高，操作简单，可准确、有效测定2,3-二甲基-6-氨基-2H吲哚盐酸盐中的乙酸含量.

参考文献：

〔1〕洪梦实,曹寅秋,谢京晶,等.帕唑帕尼的全球发明专利分析[J].中国发明与专利,2016（9）：47-53.

〔2〕周陈建,赵嫏嬛,胡国新.帕唑帕尼的临床应用和药品不良反应的研究进展[J].药学实践杂志,2016,34(6)：497-500.

〔3〕刘梦露，方丽，李振华.盐酸帕唑帕尼的合成工艺改进[J].合成化学,2014,22(1)：121-123.

〔4〕王永珍,赵砚瑾,李庶心.盐酸帕唑帕尼的合成工艺改进[J].精细化工中间体,2013,43(2)：46-47.

〔5〕祁浩飞,王兵,刘冰妮.帕唑帕尼盐酸盐的合成[J].中国现代应用药学,2011,28(1)：58-60.

〔6〕冀云涛,朱小玲,李斌鑫,等.RP-HPLC法同时测定蒙药复方协日嘎-4中栀子苷、京尼平-1-O-β-D-龙胆二糖苷、西红花苷-1、西红花苷-3的含量[J].内蒙古大学学报（自然科学版）,2016,47(6)：604-608.