淀粉颗粒形貌表征研究进展

闫溢哲,周亚萍,刘华玲,史苗苗,刘延奇,*

(1.郑州轻工业学院 食品与生物工程学院,河南郑州 450002; 2.食品生产与安全河南省协同创新中心,河南郑州 450002)

淀粉存在于多种植物中,主要贮存于植物的根、茎、种子和果实等,是自然界中存在最丰富的碳水化合物之一。淀粉是所有碳水化合物中唯一以颗粒形式存在的,颗粒结构紧密、形态多样。淀粉的颗粒尺寸一般在0.1～200 μm之间,形状大致可以分为圆形、椭圆形、肾形和多角形等[1-3]，而且淀粉颗粒并不是简单存在。研究表明几乎所有的淀粉颗粒都具有孔隙结构,称为淀粉的“脐”,这个发现使得研究者对淀粉颗粒的认知有了进一步提高,也促使大家在淀粉结构研究方面进行更深入的探索[4-5]。

研究表明淀粉颗粒形貌对淀粉性能有一定的影响,因此颗粒形貌一直是淀粉研究领域必不可少的分析指标。随着检测技术的不断改进,我们对淀粉颗粒形貌的研究水平也不断提高[6]。如扫描电子显微镜用于观察淀粉的颗粒外貌;透射电子显微镜是用来观察淀粉颗粒超微结构;偏振光显微镜可用于观察淀粉颗粒外貌以及确定淀粉结晶结构的变化;激光共聚焦显微镜用来测定淀粉颗粒内部结构;原子力显微镜更加精细,用于观察淀粉颗粒的纳米结构等。本文针对运用扫描电子显微镜(Scanning Electrical Microscope,简称SEM)、透射电子显微镜(Transmission Electron Microscope,简称TEM)、偏光显微镜(Polarizing Microscope,简称PLM)、激光共聚焦显微镜(Confocal Laser Scanning Microscopy,简称CLSM)和原子力显微镜(Atomic Force Microscope,简称AFM)这五种检测设备对淀粉颗粒形貌的表征方法进行相应概述。

1 淀粉颗粒形貌的表征方法

1.1 扫描电子显微镜(SEM)法

SEM是用来观察物体表面的一种高倍显微镜,主要是根据电子与物质之间的相互作用,利用二次电子信号微观成像来观察样品表面形态。SEM是一种细胞生物学研究工具,也被广泛用于材料学、食品药品、纺织纤维等诸多领域[7]。在淀粉研究领域,SEM是研究淀粉颗粒形貌的主要方法,使用SEM能够很好的观察到淀粉的表面形貌。样品检测前无需进行预处理,直接取微量样品粉末粘附于双面导电胶或者取微量样品悬浮液滴于铝箔片上固定样品,然后置于离子溅射仪中进行喷金,给样品镀上一层导电薄膜,避免二次电子在样品表面累积而降低图像质量。

在淀粉研究领域,SEM被广泛应用。王绍清等[8]运用SEM观察比较多种淀粉的颗粒形貌，结果表明,淀粉植物来源不同,颗粒大小和形貌也会相异，如图1所示,淀粉颗粒形态有球形、椭球形、肾形和多面体形等;颗粒大小从几微米到100 μm;颗粒结构有单粒、有复粒得出淀粉颗粒与淀粉来源在形貌上具有相似性,例如马铃薯淀粉颗粒形状像马铃薯,呈现椭球型;豆类淀粉颗粒呈现肾型,与豆类外貌相似;相近科属之间淀粉颗粒形貌也相似,如大米、糯米和紫米等米类淀粉颗粒均呈多面体型;部分淀粉颗粒在超微形貌上具有独特性,如棒形的莲藕淀粉、铁饼形的A 型小麦淀粉等。对淀粉超微形貌的观察,可以进行淀粉种类鉴定。刘延奇等[9-11]在研究A、B型淀粉球晶的制备时,运用SEM观察微晶淀粉形貌，发现B-型微晶的颗粒大小均一且颗粒之间多黏连;A-型微晶表面有凹陷和沉积,如图2所示，得出B-型微晶的黏连可能由于解冻导致淀粉表面的结晶区存在部分晶体融化,使邻近晶体之间融合粘结;而A-型微晶的形貌可能是由于高浓度导致悬浮液中的部分淀粉链在晶体表面发生沉积。后期刘延奇等[12]研究使用B-型微晶与正癸醇复合得V-型微晶淀粉。SEM下发现V-型颗粒形貌是圆饼状,类似于血红细胞,并且V-型淀粉颗粒表面更粗糙,研究结果表明复合过程中淀粉颗粒形状和大小均发生变化,如图2。

图1 SEM不同倍数下淀粉的颗粒形貌Fig.1 The morphology of starch granules in different multiples of SEM[8].注:A1,A2为高粱;B1,B2为马铃薯;C1,C2为绿豆,D1,D2为玉米;1和2分别为放大倍数×1000和×5000。

图2 A,B和V-型微晶淀粉的SEM图像Fig.2 SEM images of A,B and V-type microcrystalline starch

Thirumdas等[13]在研究低温等离子体处理对印度香米理化特性影响时,通过SEM来观察等离子体处理前后淀粉颗粒表面变化，表明等离子体处理后,淀粉颗粒表面呈现均匀的凹凸,这种效应称为“表面蚀刻”。并且,随着处理功率和时间的增加蚀刻显著增加。这种蚀刻作用导致印度香米在烹饪时吸水性增加,有效降低烹饪时间。Sarangapani等[14]也通过低压等离子体处理来改变大米的烹饪特性。结果和Thirumdas等的类似,等离子体处理能够有效地减少谷物烹饪时间,但在烹饪过程中,大米吸水率和损失也会有所增加。

在淀粉颗粒形貌表征方面,SEM是最常用的手段。其测试简单、易于操作,能够检测淀粉颗粒大小尺寸,清晰地观察淀粉颗粒的表面情况,对于淀粉的研究必不可少。

1.2 透射电子显微镜(TEM)法

TEM是一种用来观察物体亚显微或超微结构的电子光学仪器。TEM的成像原理与光学显微镜基本一致,但TEM是以波长极短的电子束作为灯源,利用电磁透镜聚焦成像,来展示物体表面或内部特征[15-16]。TEM最大的特点是高分辨率和放大倍率,但由于在检测时电子易发生散射,穿透力极低,因此样品的密度、厚度等都会影响成像质量,这就要求被测样品足够薄。样品的存在状态不同,前处理不同,固体样品需超微切片;粉末样品需制膜;有的样品在观察前还需要染色[17]。TEM主要用于材料学和生物学,在研究淀粉时也常使用TEM来检测淀粉颗粒、淀粉糊以及淀粉衍生物的外貌结构,对于淀粉颗粒形态的分析具有重要作用。

Monika和Jerzy在研究天然和水解淀粉颗粒的孔隙特征时,用TEM观察玉米、小麦、大米和马铃薯淀粉水解时的颗粒内部变化。实验结果表明酶的作用使孔面积增加,活性酶能够通过孔隙进入颗粒内部,由内而外进行水解。孔通道主要是无定形区,所以酶首先水解淀粉无定型区。且与玉米、小麦和大米淀粉相比,马铃薯淀粉颗粒结构更紧密,耐酶性更强。Monika 和Jerzy在2013年研究超声波处理淀粉时,运用TEM观察淀粉在水和乙醇介质中以20 KHz、70 W,在20 ℃下超声处理30 min后颗粒形貌的变化。TEM结果显示超声处理导致淀粉颗粒表面裂纹和凹陷(如图3);从TEM图中可以明显看到在超声处理后淀粉颗粒内部的空腔似乎更大。实验还得出与乙醇相比,以水为介质的超声处理对淀粉形貌影响更大[18-19]。

图3 天然和改性淀粉颗粒的TEM显微照片Fig.3 TEM micrographs of native and modified starch granules注:A,B,C和D分别为天然的玉米,水稻,小麦和马铃薯淀粉颗粒;1和2分别以水和无水乙醇作为介质。

姜岁岁等[20]在研究短直链淀粉纳米颗粒时,用TEM观察酶解不同时间得到的蜡质玉米淀粉纳米颗粒形貌。结果表明,随着酶解时间的延长,淀粉的颗粒形态变的不规则,有的难形成颗粒，这可能由于长时间酶解形成聚合度不同的短直链淀粉,而聚合度偏大的淀粉发生重结晶导致的。

相比SEM检测法而言,通过TEM可以获得淀粉内部清晰图像,研究淀粉改性处理时淀粉的内部变化,这对于进一步了解复杂的淀粉颗粒聚集态结构具有十分重要的意义。

1.3 偏光显微镜(PLM)法

PLM是用来检测物质的各向异性和双折射性的显微设备。PLM是在光学显微镜的光学系统中插入了起偏振镜和检偏振器,以单波长光线为光源,检测生物体内某些有序结构及其折射光学性质[21]。凡具有双折射性质的物质,在偏光显微镜下都能分辨清楚。淀粉具有一定的双折射性质,因此,PLM可用于淀粉表征,在PLM下淀粉颗粒内部晶体和非晶结构的密度和折射率差异即各向异性产生极化交叉,出现偏光十字。

杜双奎等[22-23]在研究蕨根淀粉颗粒形貌及其特性时,用PLM观察蕨根、红薯和马铃薯淀粉颗粒,根据淀粉样品不同,偏光十字位置、形状和亮暗程度会有很大差别,进而可以有效的鉴定和检测淀粉样品，结果表明红薯淀粉颗粒偏光十字位于中央,而蕨根和马铃薯淀粉颗粒的偏光十字位于粒端。作者在2011年还研究了山药淀粉,在PLM下发现山药淀粉颗粒偏光十字处于颗粒一边。

淀粉颗粒偏光十字的变化可定性表征颗粒结晶结构改变,只要淀粉颗粒内部淀粉分子链有序排列的结晶结构遭到破坏,偏光十字就会消失[24]。刘佳男等[25]在研究微波改性白高粱淀粉时,用PLM观察淀粉。结果发现,在900 W下微波间歇作用80 s预熟化处理后白高粱淀粉颗粒偏光十字模糊甚至消失、部分颗粒膨胀,这表明微波破坏了淀粉分子内部有序结晶结构。李永平[26]在研究多孔淀粉颗粒空腔结构及其晶体结构时,运用0.5%的α-淀粉酶和糖化酶复合酶解玉米和马铃薯淀粉,使用PLM观察淀粉颗粒球晶结构。结果表明,在一定酶解时间下的淀粉颗粒表面粗糙,但仍然具有很好的偏光十字,因此适当酶解并不会破坏淀粉颗粒的球晶结构,颗粒仍具有一定强度,继而得到理想的多孔淀粉。Zhu等[21]在研究超声处理对马铃薯淀粉超分子结构的改变时,在PLM下发现处理后淀粉颗粒的极化交叉保持不变(如图4所示),也就是说在该实验中超声处理对淀粉颗粒的晶型结构无影响。Zhang等[27]在研究辉光放电等离子体对淀粉多尺度结构和功能特性的影响时,也运用了PLM观察发现,随着等离子体处理时间的增加,马铃薯淀粉表面出现明显的蚀刻现象,这与Thirumdas等[13]的研究结果类似。

图4 天然和超声处理的淀粉在偏振光下的显微镜图像Fig.4 Microscope images of native and ultrasonic treated starches under polarized light注:A0,天然马铃薯淀粉;A1,A2和A3,处理功率分别60,105和155 W。

因此,PLM不仅可以用来表征淀粉,也可以用来鉴定淀粉和检测淀粉颗粒结晶结构的转变。

1.4 激光共聚焦显微镜(CLSM)法

CLSM是一种采用激光、电子摄像等高科技手段,根据共轭聚焦原理成像的先进分子生物学分析仪器[28-29]。CLSM已广泛用于形态学、分子生物学、食品科学等领域。近年来CLSM在淀粉研究领域常被用来测定淀粉的颗粒结构和特性,以及变性淀粉和淀粉材料的性能。CLSM检测需要对样品进行染色和切片处理,然后进行多层面扫描来获得样品内部图像。根据染色剂与淀粉还原基末端反应呈荧光来测定淀粉,在相同分子量条件下,直链淀粉含有的还原末端高于支链淀粉[30-31]。与传统显微镜相比,CLSM分辨率更高、放大倍率更大、更加灵敏。

Hong等[32]在2016年研究改性剂渗透时间对淀粉性能的影响时,用CLSM来表征变性玉米和小麦淀粉颗粒形貌。结果显示,淀粉颗粒外表面的反应带随着试剂渗透时间的增加而变宽,进而作者可以通过控制试剂渗透时间来有效地控制淀粉改性。同年Bie等[33]研究等离子体处理对淀粉结构和流变性影响时,用CLSM观察不同处理时间下的玉米淀粉。结果表明,随着处理时间的增加,颗粒的整体亮度增加,且玉米淀粉独特的孔结构变的更明显(如图5)。因此,等离子体处理不仅影响淀粉颗粒表面,而且还可以通过孔结构渗透到颗粒内部,导致淀粉分子还原末端的增加,荧光更强。

图5 等离子体处理不同时间后玉米淀粉颗粒的CLSM图像[33]Fig.5 CLSM images of corn starch granules at different times after plasma treatment[33]注:A0,天然玉米淀粉;A1,A2和A3,处理时间分别为1,5和10 min。

陈佩等[34]在研究糯小麦淀粉特性时,在CLSM下对比普通小麦和糯小麦淀粉,根据淀粉颗粒荧光强弱来检测颗粒中直链淀粉分布。结果表明,两种小麦淀粉颗粒的中心部位荧光较强,也就是说直链淀粉更多的存在于颗粒中心。整体来说,小麦淀粉的荧光强于糯小麦淀粉,其颗粒内部直链淀粉含量更高。李贵萧等[35]在研究高压均质对绿豆淀粉的影响时,在均质不同次数下运用CLSM观察淀粉颗粒内部结构。随着均质次数增加,淀粉颗粒内部的荧光逐渐减弱,根据减弱的区域作者发现高压均质首先破坏颗粒内部的无定型结构。

CLSM是用来表征淀粉颗粒内部结构的主要方法之一,它综合了普通显微镜和荧光显微镜的功能,使一些物质的内部结构以荧光强弱的方式展现出来,为研究者对淀粉颗粒内部的了解提供更多可能。

1.5 原子力显微镜(AFM)法

AFM是一种研究物质表面结构的分析仪器。它主要通过检测样品表面和力敏感元件之间的微观力来获得纳米级分辨率的物质表面结构信息及表面粗糙度信息。AFM的应用范围十分广泛,适用于生物、高分子、金属等的纳米结构观测,以及微球颗粒形状、尺寸及粒径分布的观测等[36]。在淀粉研究领域,AFM可用来表征淀粉颗粒表面和内部结构,研究淀粉分子链结构,使得人们对淀粉的了解更进一步[37]。

Baker等[38]利用接触式AFM观察淀粉颗粒内部的纳米结构,结果发现玉米淀粉颗粒存在放射状结构,脐心周边环绕着400～500 nm的生长环,有些颗粒脐心完全暴露,脐心出现不同深度空洞。这使研究者对玉米淀粉的颗粒结构有了进一步了解。Ridout等[39]用AFM观察玉米和马铃薯淀粉的内部结构,发现淀粉颗粒结晶结构较明显,在图像中表现为较亮区域。结果表明,淀粉内无定形区和结晶区的AFM图像呈亮暗交替排列,继而呈现了淀粉颗粒内结晶区和无定形区的排列方式。Neethirajan等[40]用AFM对硬粒小麦淀粉颗粒表面形态进行表征,如图6展示了AFM下小麦淀粉的颗粒形貌以及淀粉的生长环结构。结果发现,与非硬质颗粒相比,硬质小麦淀粉颗粒的尺寸更小;观察淀粉颗粒生长环表明,与硬质淀粉相比,非硬质颗粒内支链淀粉含量更高。

图6 小麦淀粉颗粒的AFM图像Fig.6 AFM images of wheat starch granules注:1和2分别是小麦颗粒形貌和生长环结构形貌。

孙平等[41]以乙醇为介质碱法催化法对淀粉进行改性处理,制备冷水可溶性淀粉,用AFM对原玉米和冷溶玉米淀粉颗粒的微观结构进行扫描观测。研究结果表明,与原淀粉相比,变性淀粉颗粒表面突起更尖锐。孙平认为这可能是由于在改性处理中,强碱性作用破坏了微晶束的簇状结构,使微晶束失去了氢键间的结合力,导致淀粉分子间不规则排列,从而使颗粒表面粗糙。与前4种测定方法相比,AFM的分辨明显更高,成为淀粉研究领域的一种新纳米工具,使淀粉的结构分析达到分子水平,进而使人们对淀粉颗粒结构有了更直观认识。

2 五种表征方法对比

淀粉颗粒形貌表征的五种方法中(表1),SEM是最常用的一种方法,样品无需预处理,其放大倍数大、视野宽广、成像立体,可直接观察到样品表面凹凸不平的细微结构,且成本低;TEM涂覆样品必须薄,对真空要求高,常用于物质超微结构分析,分辨率比SEM更高,但是样品预处理复杂,检测成本高;PLM样品处理简单,可直接观察到淀粉颗粒形貌,还可以根据淀粉颗粒偏光十字和荧光来判断淀粉颗粒结晶特性;CLSM可以对样品进行断层扫描成像,无损伤观察和分析样品内部三维空间结构,但样品预处理步骤繁多,检测费用极高;AFM可用来观察淀粉颗粒表面纳米级分辨率以及颗粒内部结构和分子链结构,其工作环境要求低,但样品制备难度大,检测费用高。

表1 淀粉颗粒形貌5种表征方法对比Table 1 Comparsion among five determination methods for morphology of starch granules

3 结论与展望

SEM、TEM、PLM、CLSM和AFM可分别用于表征淀粉颗粒外貌、超微结构、结晶结构、颗粒内部结构以及纳米结构。这几种方法都可以用来观察淀粉的外部形貌、立体分布、颗粒堆积等,做为一种辅助工具来研究淀粉改性处理前后的性能变化。由于淀粉颗粒形态多样、结构复杂,对其深入研究需要多种设备辅助,研究人员可以根据自己的实验要求来选择合适的检测方法。

综上所述,在研究淀粉形貌时,其表征方法和设备的选择十分重要,具有极大的研究价值。但是受现阶段仪器设备及其检测方法所限,我们对淀粉颗粒形貌的研究精细度还远远不够。为了满足淀粉结构精细度研究要求,开发更先进的仪器设备,发展更快速更精密的检测方法,是将来该领域的发展方向。例如,2017年的诺贝尔奖化学奖颁发给了冷冻电镜研究者理查德·亨德森等人,他们开发的冷冻电镜,能在低温条件下,更好地确保光束的强度以及被测样品的原生态。这些新技术的应用将提高淀粉工业的行业竞争力,具有广阔的前景。

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