桑葛降糖粉的生产工艺与体外活性研究

郏文青,张 显,余婷婷,张 娇,魏 屹,*

(1.西南交通大学生命科学与工程学院,四川成都 610031; 2.泸州百草堂健康产品有限公司,四川泸州 646000)

糖尿病为一种普遍的内分泌代谢性疾病,它与心血管疾病、癌症构成了危害人类健康的三大疾病[1],发病率呈现逐年上升的趋势。高血糖及糖尿病多在40岁之后发病,占糖尿病患者90%以上[2]。古代中医认为糖尿病的发生与情绪失控、饮食不节、劳欲过度有关,主要从消渴症和肾病的发病机制、药物、食品调节以及情绪等方面来治疗[3]。现代西医对于糖尿病治疗方式则包括:口服降糖药、血糖的自我监测、胰岛素治疗、合理运动、饮食控制等[4]。目前这类疾病无法根治,一旦患上需终身治疗。对于这种需长期治疗的疾病,人们更希望通过健康安全的方法达到预防治疗效果,因此降糖保健食品的开发成为了当下重要的新兴产业。我国药食两用的降糖资源丰富,如山药、桑叶、葛根、南瓜、蜂胶、燕麦等均含有大量降糖成分[5]。但是对于这些天然有效的资源缺乏充分利用。

桑葛降糖粉作为一种新型降糖保健食品,正处在研究阶段,所用药材均是药食两用的,安全无毒,且按照中医配伍理论组方,实现整体调节,不仅有利于提高药效,还可减少副作用[6]。制备工艺中,桑叶和葛根需提取有效成分来应用,因此需要结合药材的理化性质、药理作用设计桑叶和葛根的最佳提取工艺。

桑葛降糖粉的主要有效成分之一是多糖,大量研究表明植物多糖具有降血糖活性[7-10],其机制之一是抑制α-葡萄糖苷酶的活性,延缓葡萄糖在小肠的吸收。α-葡萄糖苷酶在食物碳水化合物代谢过程中发挥着重要作用,它参与机体食物的消化、糖蛋白的生物合成、多糖及糖复合物的合成与分解代谢等多个生物过程[11]。研究表明,抑制α-葡萄糖苷酶的活性,不仅有助于控制糖尿病的发展,还可以减少并发症的发生[12-13]。因此本实验通过验证桑葛降糖粉对α-葡萄糖苷酶的抑制活性研究其体外降血糖活性。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

葛根素对照品,批号150602 成都克洛玛生物科技有限公司;桑叶、葛根、山药、人参、百合、昆布 市售,经西南交通大学生命科学与工程学院宋良科教授鉴定,分别为桑科植物桑(MorusalbaL.)的干燥叶,豆科植物野葛(Puerarialobata(Willd)Ohwi)或粉葛(P.thomsoniiBenth)的干燥根,薯蓣科植物薯蕷(DioscoreaoppositaThunb.)的干燥根茎,五加科植物人参(Pana:cginsengC. A. Mey.)的干燥根和根茎,百合科植物卷丹(LiliumlancifoliumThunb.)、百合(LiliumbrowniiF.E.Brown var.viridulumBaker)或细叶百合(LiliumpumilumDC.)的干燥肉质叶,海带科植物海带(LaminariajaponicaAresch.)或翅藻科植物昆布(EchloniakuromeOkam.)的干燥叶状体;α-葡萄糖苷酶(α-glucosidase)、4-硝基苯-α-D-吡喃葡萄糖苷(4-N-trophenyl-α-D-glucopyranoside,PNPG)、阿卡波糖水合物(Acarbose) 均购自Macklin公司;其余试剂 均为分析纯。

DK-98-1型电热恒温水浴锅 天津市泰斯特仪器有限公司;TD5A型离心机 湖南凯达科学仪器有限公司;Christ Alphal-4型冷冻干燥机 德国Christ公司;DHP-9162型电热恒温培养箱 上海齐欣科学仪器有限公司;Varioskan Flash型全波长扫描多功能读数仪 美国赛默飞世尔科技有限公司。

1.2 实验方法

1.2.1 桑葛降糖粉的制备工艺流程 根据药典中对各味药材的用量规定[14]和保健食品原料管理办法[15],结合处方功效的分析得到配方比例为,葛根∶人参∶桑叶∶山药∶百合∶昆布(3∶0.4∶4∶3∶2∶6)。与本处方功能相关的有效成分主要为桑叶多糖[16]和异黄酮类成分葛根素[17],桑叶多糖易溶于水,葛根素较易溶于乙醇、甲醇等极性溶剂中,考虑食用安全性,分别选择水和乙醇为溶剂提取有效成分,再综合处方中其他药材性质、药理作用和保健食品剂型,设计制备工艺,见图1。

图1 桑葛降糖粉的生产工艺Fig.1 Production process of SangGe powder

1.2.2 标准曲线的绘制

1.2.2.1 葡萄糖标准曲线绘制 精密称取105 ℃烘干至恒重的葡萄糖对照品适量,置容量瓶中,以甲醇溶解制得浓度为0.1 mg/mL的葡萄糖标准溶液,精密量取葡萄糖对照品溶液0.2、0.4、0.6、0.8、1.0 mL分别置于10 mL容量瓶,分别加蒸馏水至1.0 mL,另加1.0 mL蒸馏水于空白容量瓶中作为空白对照。精密加入0.8 mL 5%苯酚溶液,混匀,迅速加6.0 mL浓硫酸溶液,振摇5 min,置沸水浴中加热20 min后取出,再置冷水中冷却30 min。在490 nm处测吸光度,平行测定3次,取平均值,以葡萄糖浓度C(mg/mL)为横坐标,吸光度A为纵坐标,绘制葡萄糖标准曲线。

1.2.2.2 葛根素标准曲线绘制 精密称取6.0 mg葛根素对照品置50 mL容量瓶中加70%乙醇定容至刻度,制成浓度为0.012 mg/mL的对照品溶液。分别精密量取0、0.2、0.4、0.6、0.8、1.0、1.5、2.0 mL葛根素对照品溶液按编号为1～8于25 mL容量瓶中,用70%乙醇定容至刻度,1号作空白对照。在250 nm下测定吸光度,绘制葛根素的标准曲线。

1.2.3 正交实验设计

1.2.3.1 因素水平设计 对葛根和桑叶的提取方法已有大量研究报道,则不再考察单因素实验,参考相关文献[18-21],结合药材有效成分的理化性质、药理作用,分别设计了桑叶和葛根的L9(3)4正交实验因素水平表,见表1和表2。所得提取物分别按照相应标准曲线下的方法处理并测定吸光度,通过标准曲线计算多糖得率和葛根素得率,计算干膏得率,最终以综合评分为评价指标。

表1 桑叶提取因素水平表Table 1 Factor and level of Mulberry leaf

表2 葛根提取因素水平表Table 2 Factor and level of Pueraria

1.2.3.2 测定公式 多糖得率,干膏得率,综合评分的计算公式。

多糖得率X(%)=C×V×D/W×100

式中,C为提取液中多糖浓度(g/L);V为提取液体积;D为稀释倍数;W为原料质量(g)。葛根素得率算法同上。

干膏得率Y(%)=(M1-M0)/m×100

式中,M1为干膏与蒸发皿总重(g);M0为空蒸发皿重量(g);m为提取药材质量(g)。

综合评分Z=(X/Xmax)×50+(Y/Ymax)×50

式中,X为多糖得率或葛根素得率,Xmax为多糖得率或葛根素得率的最大值;计为50分。Y为干膏得率,Ymax为干膏得率最大值;计为50分。

1.2.4 桑葛降糖粉的体外活性考察

1.2.4.1 试剂的配制 取一定量的磷酸二氢钾和磷酸氢二钾,配制pH6.8的磷酸盐缓冲溶液(PBS)。

α-葡萄糖苷酶溶液:取一定量的α-葡萄糖苷酶(α-glucosidase)粉末,用 pH6.8的PBS溶液配成浓度为6 U/mL的α-葡萄糖苷酶溶液。

4-硝基苯-α-D-吡喃葡萄糖苷(PNPG)溶液:取一定量PNPG粉末,用pH6.8的PBS溶液配成浓度为 10 mmol/L 的PNPG溶液。

碳酸钠(Na2CO3)溶液:取一定量Na2CO3粉末,用蒸馏水将其配成浓度为 0.1 mol/L的Na2CO3溶液。

1.2.4.2 桑叶多糖和桑葛降糖粉中总多糖的提取 按照1.2.1项下的生产工艺制备桑葛降糖粉。采用传统的水提法提取多糖。参考文献[22-23]方法,称取桑叶粉末(过4号筛)和桑葛降糖粉各10 g,先以料液比1∶5,加入无水乙醇索氏提取4 h,除去脂溶性成分,再以料液比1∶10加入蒸馏水,回流提取2 h,过滤,弃去滤渣,将滤液浓缩至原体积的1/4,按体积比1∶4加入80%乙醇,4 ℃醇沉,3000 r/min 离心20 min,取沉淀,加蒸馏水溶解,经 Sevage法脱蛋白,冷冻干燥得桑叶多糖和桑葛降糖粉总多糖,备用。

1.2.4.3α-葡萄糖苷酶抑制活性的测定方法 参考文献[24-25]测定方法,用合适量程的移液枪取上述制备的不同浓度的阿卡波糖溶液和多糖溶液各40 μL于96孔板中,再向各孔中加入40 μLα-葡萄糖苷酶(α-glucosidase)溶液,混匀,于37 ℃下保温10 min,取出,加入30 μL PNPG溶液,混匀,在37 ℃下反应30 min,最后加入90 μL Na2CO3溶液,终止反应。用酶标仪测定405 nm处光吸收值(OD),同时设立空白组和背景组,计算抑制率。

式中:OD空白- PBS(40 μL)+α-glucosidase(40 μL)+PNPG 溶液(30 μL)+Na2CO3溶液(90 μL)条件下测得的吸光值;OD样品-多糖溶液(40 μL)+α-glucosidase(40 μL)+PNPG 溶液(30 μL)+Na2CO3溶液(90 μL)条件下测得的吸光值;OD背景-多糖溶液(40 μL)+PBS(40 μL)+PNPG溶液(30 μL)+Na2CO3溶液(90 μL)条件下测得的吸光值。

1.2.5 酶促反应条件的优化

1.2.5.1 酶浓度对酶促反应的影响 按照1.2.4反应体系,在不加抑制剂的条件下,加入不同量(10、20、30、40、50、60、70 μL)6 U/mL的α-葡萄糖苷酶溶液,向各孔中加入30 μL浓度为10 mmol/L的PNPG溶液,于37 ℃下反应30 min,测定OD 值。酶用量的多少与缓冲盐的体积进行调节,以保证实验过程中反应体系的总量(200 μL)不变。

1.2.5.2 底物浓度对酶促反应的影响 按照1.2.4反应体系,在不加抑制剂的条件下,加入50 μL 6 U/mL的α-葡萄糖苷酶溶液,测定30 μL不同底物浓度(1、2、4、6、8、10 mmol/L)PNPG溶液,于37 ℃下反应30 min,测定OD值。

1.2.5.3 加入PNPG后反应时间对酶促反应的影响 按照1.2.4反应体系,在不加抑制剂的条件下,加入50 μLα-葡萄糖苷酶溶液,加30 μL 8 mmol/L的PNPG溶液,反应温度为37 ℃,测定加入PNPG后反应(10、20、25、30、35、45 min)的OD值。

1.2.6 阿卡波糖及多糖溶液对α-葡萄糖苷酶抑制作用的浓度效应测定 精密称定250 mg阿卡波糖和1.2.4.2项下制备的总多糖和桑叶多糖,分别置于50 mL容量瓶中,加PBS溶液溶解,配制成5 g/L阿卡波糖原溶液和多糖原溶液。再取该原溶液,用PBS溶液稀释成(0.05、0.1、1、2、3、4 g/L)不同浓度的溶液。按照1.2.5项下优化得到的反应条件测定吸光度,计算抑制率,以浓度为横坐标,抑制率为纵坐标,绘制曲线并求方程,计算IC50。

1.3 数据处理

实验数据采用SPSS 20.0统计软件进行处理,Origin 8.0作图。

2 结果与分析

2.1 葡萄糖标准曲线

葡萄糖的标准曲线方程为y=6.69x+0.006(R2=0.9995),桑叶多糖的提取以葡萄糖计在0.02～0.10 mg/mL范围内线性良好。

2.2 葛根素标准曲线

葛根素的标准曲线方程为y=0.0531x+0.0077(R2=0.9998),葛根素在0.96～9.6 mg/mL范围内线性较好。

2.3 正交实验结果

2.3.1 桑叶的提取工艺优化结果 由表3中极差RC>RB>RA>RD得到各影响因素对综合评分的影响关系是C>B>A>D。可见提取次数对桑叶提取工艺的影响最大。由表4可看出,提取时间、提取次数、溶剂用量对桑叶提取工艺具有显著性影响(p<0.05);通过正交实验结果显示各因素水平为A3B1C3D1,由于提取温度与其他几个因素比较,相差较大,将其作为误差项进行方差分析。为了减少温度的影响,选择均值最小的水平,因此最终确定桑叶的提取条件为A3B1C3D2。

表3 桑叶提取工艺正交实验Table 3 Orthogonal test of mulberry leaf extraction process

表4 桑叶提取工艺方差分析Table 4 Analysis of variance of Mulberry leaf extraction process

2.3.2 葛根的提取工艺优化结果 表5正交实验结果显示最佳工艺条件为A3B2C2D2,分析可知,葛根素属于异黄酮类成分,用极性与葛根素极性相似的70%乙醇溶液作为提取溶剂,一定量溶剂中葛根素的扩散达到平衡后,可溶出的葛根素越来越少,因此需要进行多次提取,但是提取次数太多会导致更多杂质的溶出。温度对其也有一定影响,既要将其有效成分提取出来,又不能因为温度太高而导致乙醇损耗严重和葛根素被破坏,因此需要选择合适温度保持微沸,该实验结果显示80 ℃的温度最佳。溶剂用量过少,葛根素不能被完全提取,而过多会将其稀释,都会导致葛根素得率低。极差结果为RC>RB>RD>RA,可知提取次数对葛根素的提取影响最大,提取时间对其影响较小,以提取时间作为误差项进行方差分析,结果显示,提取次数对葛根素的提取具有显著性影响。由于选择提取时间作为误差项,为减少其影响,因此选择提取时间均值最小的水平,最终得到葛根素的最优提取工艺为A2B2C2D2。

表5 葛根提取工艺正交实验Table 5 Orthogonal test of Puerarin extraction process

表6 葛根提取工艺方差分析Table 6 Analysis of variance of Puerarin extraction process

2.3.3 工艺验证结果 桑叶多糖的得率为3.86%,干膏得率为14.26%;葛根素的得率为26.30%,干膏得率为33.80%。与正交实验表中的最高结果比较,桑叶提取的综合评分为100.97,葛根提取的综合评分为100.12,表明该提取工艺效果较好。

2.4 体外活性测定结果

2.4.1 桑葛降糖粉中总多糖的含量测定 采用苯酚-硫酸法测定桑葛降糖粉中总多糖的含量,标准曲线制备及测定方法同1.2.1.1。结果桑葛降糖粉中总多糖的多糖得率为19.0%,冷冻干燥后得到的多糖质量为0.7785 g。

2.4.2 酶促反应条件的优化

2.4.2.1 酶浓度对酶促反应的影响 通常情况下,吸光度值与酶浓度呈正比,酶浓度越高,反应生成的对-硝基苯酚(p-Nitrophenol,PNP)越多,吸光度越大,如图2,但是当酶用量高于50 μL后,吸光度值的增长缓慢,可能是因为底物的水解已趋于完全,即使增加酶用量也没有PNPG可以被水解了。

图2 酶用量对反应的影响Fig.2 Effect of enzyme protein concentration on the reaction

2.4.2.2 底物浓度对酶促反应的影响 由图3可知,酶浓度一定时,在1～10 mmol/L底物浓度范围内,吸光度随底物浓度的增加呈对数增长,其方程为y=0.064ln(x)+0.1909(R2=0.9962),即随着浓度的增加,吸光度的增长逐渐变得缓慢。分析可能是由于与底物结合的酶有限,所以增加底物浓度,却无法继续发生反应。当底物浓度为8 mmol/L时,吸光度增加较少且趋于平缓,因此选择底物浓度为8 mmol/L。

图3 底物浓度对反应的影响Fig.3 Effect of substrate concentration on the reaction

2.4.2.3 加入PNPG后反应时间对酶促反应的影响 由图4可知,随着加入底物PNPG后反应时间的延长,吸光度值也逐渐增加。10～35 min时,吸光度随着反应时间延长而增加较快,35～45 min增长趋于平缓。可能是因为到35 min时,反应已趋于完全,所以反应时间选择35 min。

图4 加入PNPG后反应时间对反应的影响Fig.4 Effect of the reaction time after adding PNPG on the reaction

2.4.3 桑葛降糖粉多糖溶液对α-葡萄糖苷酶抑制作用的浓度效应测定及与桑叶多糖的比较 阿卡波糖对α-葡萄糖苷酶的抑制作用已经被应用在临床,用于治疗糖尿病,可以有效地降低餐后血糖水平的升高。随着阿卡波糖浓度的增加,抑制率增强。用上述优化后的条件进行实验,结果表明桑葛降糖粉中总多糖对α-葡萄糖苷酶的抑制率与浓度也呈对数增长,当浓度增加到1 g/L时,对α-葡萄糖苷酶的抑制作用增强缓慢,随着浓度的增大,桑葛降糖粉的抑制率与阿卡波糖更加接近。结果如图5,曲线方程分别为,阿卡波糖:y=0.1144ln(x)+0.813(R2=0.9825),IC50为0.0648 g/L。桑葛降糖粉总多糖:y=0.1435ln(x)+0.7412(R2=0.9876),IC50为0.1862 g/L,桑叶多糖:y=0.132ln(x)+0.62789(R2=0.9815),IC50为0.3798 g/L。结果显示桑葛降糖粉对α-葡萄糖苷酶具有较好的抑制作用,且与桑叶多糖相比,半抑制浓度降低了50%,抑制作用显著提高(p<0.01)。

图5 桑葛降糖粉多糖溶液浓度对α-葡萄糖苷酶活性的影响Fig.5 Effects of polysaccharide from SangGe powder solutions concentration on α-glucosidase activity

3 结论与讨论

为充分发挥药物作用、符合保健食品注册规定以及适于企业大规模生产,选用了合适的提取溶剂,通过正交实验得到桑叶多糖和葛根素的最佳提取工艺,确定了桑葛降糖粉的制备工艺。通过体外活性实验初步判断该保健食品降血糖的效果,与阿卡波糖对照,虽然桑葛降糖粉活性稍低于对照品,但对α-葡萄糖苷酶仍然有良好的抑制活性,说明该制备工艺可行。通过查阅资料发现,桑叶多糖本身具有α-葡萄糖苷酶抑制活性[26]。实验通过与桑叶多糖比较发现,相同浓度下,桑葛降糖粉中总多糖对α-葡萄糖苷酶的抑制作用比桑叶多糖有显著的提高(p<0.01)。表明其他几味药材的协同作用,使得桑葛降糖粉的α-葡萄糖苷酶抑制活性得到了很好的改善。此结果不能完全说明桑葛降糖粉具有良好的降血糖作用,还需对其进行深入的体内活性研究和探讨,但是为接下来的研究奠定了基础。

桑葛降糖粉充分利用了药食两用药材的降血糖作用,填补了市场上降血糖保健食品的这个空缺。但是桑叶性寒,葛根发散之力易伤胃阴,单独使用不仅效果有限,而且长期服用会有不良反应。人参、山药性温、平,且人参具有固涩之效,从而可以减少桑叶葛根单独使用的不良反应,再加以百合清心安神和昆布利水散结的作用更有利于改善患者消渴烦躁等症状,也使得桑葛降糖粉除了具有降血糖作用,还可以改善血液循环,调节血液中血糖浓度,因此具有很高的研究价值。

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