去甲斑蝥素调控YAP增强A549细胞对顺铂的敏感性

郭纪伟，武 艳，金 丹，陈微微，代娟娟

(滨州医学院附属医院 1.肿瘤研究实验室、2.疼痛科， 山东 滨州 256603)

YAP信号通路是近年来揭示出的控制细胞增殖与凋亡的内在关键调控通路[1-2]。YAP信号通路功能异常后将促进细胞增殖，同时抑制细胞凋亡等过程，导致组织呈肿瘤状过度生长[3-4]。 YAP信号通路尤其是YAP分子与肺癌的发生、发展和转移的关系报道较多，但其与顺铂敏感性的关系迄今未见详细研究和报道[5-6]。

顺铂(cisplatin，DDP)是治疗肺癌的一种常用化疗药物。它是细胞周期非特异性的毒性抗肿瘤药物，同时也是第一种用于临床的金属类化疗药物[7-8]。但是病人使用高剂量的顺铂后极易产生耐药，最后导致较高的死亡率[9]。如何降低顺铂耐药，增强细胞对DDP的敏感性已经成为肺癌临床治疗急需解决的问题[10]。去甲斑蝥素(norcantharidin，NCTD)是由斑蝥素反应合成，与斑蝥素构型相同，去掉了1，2位甲基。NCTD毒副作用小，对泌尿系统基本无刺激性[11-12]。大量的实验研究表明，NCTD对常见肿瘤细胞生长有抑制作用，重要的是其不会产生抗药性[13]，在临床上具有广泛的应用，但其发挥作用的分子机制目前尚未十分明确[14]。本文以A549细胞为实验对象，阐明YAP在肺癌细胞增殖中的分子机制，并研究联合应用低浓度的NCTD和DDP对A549细胞活力、细胞增殖、顺铂的敏感性及对YAP分子的影响。最终为肺癌临床治疗中联合应用低浓度的NCTD和DDP提供新的治疗思路并奠定理论基础。

1 材料

1.1细胞株及细胞培养人肺癌细胞HBEC、A549、H1299、Calu6、H520购自美国模式培养物研究所(ATCC)。细胞用含10%胎牛血清和1%(V/V)青霉素-链霉素的RPMI 1640培养基于37℃、5% CO2及饱和湿度环境的培养箱中培养。

1.2试剂RPMI 1640培养基和胎牛血清购自美国Hyclone公司，兔抗人caspase-3、Annexin V、YAP、CTGF和Cyr61单克隆抗体购自Abcam公司，MTT和CCK-8试剂购于碧云天公司，免疫荧光二抗488和547购于Thermo公司，ECL发光试剂盒购自Thermo公司，顺铂和去甲斑蝥素粉末购自山东齐鲁制药。

1.3仪器CO2细胞培养箱，美国Thermo公司；激光共聚焦显微镜，美国Leica公司；酶标仪，美国Bio-Tek公司。

2 方法

2.1CCK-8检测细胞增殖活性常规培养A549细胞，选取对数生长期的细胞，以5×103个/100 μL接种于96 孔板。细胞贴壁后，加入不同浓度的NCTD (0、2、4、8、10、12 mg·L-1)和DDP(0、1、2、4、6、8 mg·L-1)，同时设调零孔，每组设3个复孔。分别作用60 h，每孔再加入CCK-8 10 μL，37℃震荡10 min，采用酶标仪测定各孔在450 nm波长处吸收度(OD)值，并计算A549细胞存活率。细胞存活率=(OD处理组-OD空白组) /(OD对照组-OD空白组)×100%。

2.2MTT检测细胞增殖曲线常规培养A549细胞，选取对数生长期的细胞，以3×103个/孔接种于96孔板。细胞贴壁后，加入4 mg·L-1的NCTD和4 mg·L-1的DDP及同时加入以上两个浓度的NCTD和DDP，并设调零孔，每组设3个复孔。分别作用24、48、60、72、96 h，然后，每孔加入MTT (5 g·L-1) 10 μL，继续培养4 h后，每孔再加入DMSO 100 μL，37℃震荡10 min，直至紫褐色沉淀完全溶解。采用酶标仪测定各孔在570 nm波长处吸收度(OD)值，并绘制肺癌细胞生长曲线。

2.3RT-PCR4 mg·L-1的NCTD和4 mg·L-1的DDP及同时加入以上两个浓度的NCTD和DDP处理细胞后，收集细胞。按试剂盒说明书提取RNA，然后取10 μL 总RNA逆转录合成cDNA。按照 TransGen EasyTaq PCR SuperMix 试剂盒说明书进行操作，以GAPDH作为内参校正，以3次独立重复实验的平均结果作为实验结果，用Image J软件分析实验结果。本实验RT-PCR 引物序列：YAP 上游引物：5′-GGACCCCAGACGACTTCCTCAACAG-3′，YAP 下游引物：5′-CCTTCCAGTGTGCCAAGGTCCACAT-3′；CTGF 上游引物：5′-AATGCTGCGAGGAGTGGGT-3′，CTGF 下游引物：5′-CGGCTCTAATCATAGTTGGGTCT-3′；Cyr61 上游引物：5′-GAGTGGGTCTGTGACGAGGAT-3′，Cyr61 下游引物：5′-GGTTGTATAGGATGCGAGGCT-3′;GAPDH 上游引物：5′-CTCCTCCTGTTCGACAGTCAGC-3′，GAPDH 下游引物：5′-CCCAATACGACCAAATCCGTT-3′。

2.4Westernblot检测收集处理的细胞，NP40裂解液裂解细胞后，BCA法测定蛋白浓度。加入上样缓冲液，取30 μg样品进行SDS-PAGE电泳，转膜，孵育caspase-3、Annexin V、YAP、CTGF和Cyr61的单克隆一抗后，孵育二抗，并利用化学发光成像系统成像，Image J 软件分析图片灰度值。

2.5免疫荧光细胞种植于内含盖玻片的24孔板内，24 h后，用4 mg·L-1的NCTD和4 mg·L-1的DDP及同时加入以上两个浓度的NCTD和DDP处理A549细胞60 h。除去培养基，PBS缓冲液冲洗3次，每次3 min，加入100 μL Vazyme试剂盒中的1×Binding Buffer重悬细胞，然后加入5 μL Annexin V-FITC和5 μL PI染液，轻轻混匀，避光，室温反应10 min，取出盖玻片并置于载玻片上。样品在1 h内荧光显微镜检测，Image J 软件分析荧光强度。

2.6荧光素报告基因检测常规培养A549细胞，选取对数生长期的细胞接种于6孔板，24 h后，用4 mg·L-1的NCTD和4 mg·L-1的DDP及同时加入以上两个浓度的NCTD和DDP药物处理A549细胞60 h，吸尽细胞培养液后，每孔加入200 μL的细胞裂解液，并达到室温，取样品50 μL，加入100 μL萤光素酶检测试剂，用移液枪吹打均匀，测定RLU (relative light unit)。以细胞裂解液为空白对照，采用酶标仪检测荧光强度。

2.7细胞株转染常规培养A549细胞，选取对数生长期的细胞接种于6孔板。细胞贴壁12 h后，每孔加入1.5 μg的pcDNA-Flag YAP质粒或1 μg的小干扰RNA siYAP，然后每孔加入3 μL的Lipofectamine®2000 (Thermo公司)进行细胞株转染。细胞处理48 h后，进行相关实验检测。

3 结果

3.1YAP在肺癌细胞中高表达且处于活化状态RT-PCR实验表明，肺癌细胞A549、H1299、Calu6、H520中YAP的mRNA表达水平与正常对照组细胞HBEC相比明显增加(Fig 1A)，并具有统计学意义(Fig 1B)。且Western blot结果表明，肺癌细胞中YAP分子的蛋白水平与HBEC细胞相比，同样明显增加(Fig 1C)，差异具有统计学意义(Fig 1D)。但是非活化形式的YAP即p-YAP的蛋白水平在肺癌细胞中的表达水平明显低于正常的HBEC细胞(Fig 1C、1D)。以上实验结果表明，YAP在肺癌细胞中高表达，且处于活化状态。

3.2YAP分子调控A549细胞的增殖RT-PCR和Western blot实验表明，利用小RNA干扰技术(siRNA)可降低YAP的表达水平，瞬时转染pcDNA-FlagYAP可增加YAP的表达水平(Fig 2A、2B)。CCK-8和MTT 检测结果显示，降低YAP的表达可明显抑制A549细胞的增殖，过表达YAP可明显促进A549细胞的增殖(Fig 2C、2D)。以上实验结果表明，YAP分子调控A549细胞的增殖。

3.3NCTD联合DDP增强A549对顺铂的敏感性且抑制细胞增殖CCK-8检测结果表明，低浓度的NCTD(0～4 mg·L-1)和DDP(0～4 mg·L-1)不影响A549细胞的增殖能力，高浓度的NCTD(>8 mg·L-1)和DDP(>6 mg·L-1)随着浓度的增加，对A549细胞增殖的抑制作用也随之增加(Fig 3A、3B)。CCK-8和MTT检测结果表明，联合应用低浓度的NCTD(4 mg·L-1)和DDP(4 mg·L-1)可明显抑制细胞的增殖(Fig 3C、3D)。以上数据表明，联合应用低浓度的NCTD和DDP可增强A549对顺铂的敏感性，并且抑制细胞增殖。

Fig 1 Aberrant activation of YAP in lung cancer cells

A, B: The mRNA level of YAP was detected by RT-PCR assay in different lung cancer cells; C, D: The protein level of YAP was detected by Western blot in different lung cancer cells.**P<0.01vsnormal control HBEC cells.

Fig 2 YAP promoted cell proliferation in A549 cells

A, B: The mRNA and protein levels of YAP were detected in A549 cells by treatment with siRNA and stably expressing YAP.The cellular proliferation was detected by CCK-8 (C) and MTT assay (D) in A549 cells.**P<0.01vscontrol group.

Fig 3 NCTD combined with low concentration of DDP enhanced sensitivity of DDP and inhibited cell proliferation in A549 cells

The cell proliferation was detected by CCK-8 assay in A549 cells treated with different concentrations of NCTD (A) and DDP (B).CCK-8 (C) and MTT assay (D) indicated that the treatment combined with low concentration of DDP and NCTD significantly arrested cell proliferation in A549 cells.*P<0.05,**P<0.01vscontrol group.

3.4NCTD联合DDP增强A549对顺铂的敏感性且诱导细胞凋亡Western blot结果表明，联合应用低浓度的NCTD和DDP上调细胞凋亡标记物，即活化形式的cleaved caspase-3的表达水平(Fig 4A)，差异具有统计学意义(Fig 4B)。免疫荧光实验表明，联合应用低浓度的NCTD和DDP增加Annexin V的表达水平(Fig 4C)，差异具有统计学意义(Fig 4D)。以上结果表明，联合应用低浓度的NCTD和DDP增强A549对顺铂的敏感性，促进细胞凋亡。

3.5NCTD联合DDP增强A549对顺铂的敏感性且影响YAP的转录活性荧光素报告酶检测结果表明，联合应用低浓度的NCTD和DDP降低YAP的转录活性(Fig 5A)。RT-PCR和Western blot实验表明，联合应用低浓度的NCTD和DDP降低YAP的mRNA和蛋白水平(Fig 5B)，差异具有统计学意义(Fig 5C)。

3.6NCTD联合DDP增强A549对顺铂的敏感性且降低YAP靶基因的表达YAP信号通路激活时，辅转录因子YAP与转录因子TEAD家族蛋白结合，调控下游靶基因CTGF和Cyr61等表达，从而影响细胞增殖和凋亡[3]。RT-PCR实验表明，联合应用低浓度的NCTD和DDP降低YAP靶基因CTGF和Cyr61的mRNA水平(Fig 6A、6B)。Western blot结果同样表明，联合用药降低YAP靶基因的蛋白水平(Fig 6C、6D)

4 讨论

肺癌是一种发病率和死亡率极高的恶性肿瘤。近年来，其发病率与死亡率在我国及世界范围内均呈上升趋势，目前，已成为我国最难治愈的肿瘤疾病。肺癌患者发现时已处于中晚期，且多器官继发性转移，5年生存率很低，因此，肺癌是所有肿瘤中最难治愈的一种。本课题以肺癌细胞A549为研究内容，阐明YAP分子在肺癌细胞增殖和对顺铂敏感性中的分子机制，为肺癌的临床治疗和提高病人的生存期具有非常重要的意义。

Fig 4 NCTD combined with low concentration of DDP induced apoptosis

A: The protein level of activated caspase-3 was detected by Western blot in A549 cells; B: The quantified results of A; C: The protein level of Annexin V was analyzed by immunofluorescent staining in A549 cells; D: The quantified results of C.**P<0.01vscontrol group.

YAP信号通路是近年来揭示出的控制细胞增殖与凋亡的内在关键调控通路。YAP信号通路的核心蛋白分子元件包括两种激酶MST和LATS，构架蛋白SAV和MOB以及转录复合体YAP和TEAD。YAP为辅助转录激活因子， 其被LATS磷酸化后滞留在细胞质中，随后被降解，从而失去其在细胞核中与TEAD结合调节靶基因转录的活性。YAP作为一个潜在癌基因，一方面YAP与细胞核内转录激活因子TEAD家族蛋白结合，影响肿瘤细胞内多种癌基因的转录，促进肿瘤细胞的增殖。所以YAP功能失调后，促进细胞增殖，有利于正常细胞向恶性肿瘤细胞转化[1-3]。另一方面，YAP促进凋亡抑制因子(inhibitor of apoptosis proteins, IAPs)的表达，从而抑制肿瘤细胞的凋亡[2-5]。鉴于YAP在增殖和凋亡过程中的作用，说明YAP在维持组织器官的稳定性和正常的生理活动中具有非常重要的作用。

尽管顺铂作为治疗肺癌首选的化疗药物在临床上得到了广泛运用，但使用高浓度的顺铂引起的化疗耐受增加了肺癌病人的死亡率，是目前导致肺癌化疗失败的重要原因。如何有效地降低DDP的耐受性，缓解使用DDP对机体产生的伤害是DDP临床应用所要解决的新问题。本研究表明，YAP在肺癌细胞中高表达且处于活化形式，过表达YAP后促进了A549细胞的增殖，说明YAP在肺癌的发生与进展中可能起着非常重要的作用。高浓度的DDP能够抑制细胞的增殖，但是其加剧了细胞的耐受性和对机体产生的伤害。课题组前期发现，NCTD通过调控YAP活性抑制细胞增殖，促进细胞凋亡[14]。因此，我们联合应用低浓度的NCTD和DDP处理细胞。结果表明，低浓度的联合用药明显抑制细胞的增殖，且促进细胞凋亡。进一步的研究结果表明，联合应用低浓度的NCTD和DDP抑制YAP的转录活性，并降低YAP靶基因CTGF和Cyr61的表达水平，进而调控细胞增殖与凋亡。

Fig 5 NCTD combined with low concentration of DDP significantly decreased YAP activities

A: The transcriptional activities of YAP promoter was examined by luciferase reporter gene assays in A549 cells; B: The mRNA and protein expressions of YAP were analyzed by RT-PCR and Western blot in A549 cells; C: The quantified results of B.**P<0.01vscontrol group.

综上所述，联合应用低浓度的NCTD和DDP可抑制YAP转录活性，降低YAP靶基因的表达水平，进而抑制细胞增殖并促进细胞凋亡，最终增强A549细胞对DDP的敏感性。本研究为肺癌的临床治疗中联合应用DDP和NCTD提供了新的治疗思路及理论基础。

Fig 6 NCTD combined with low concentration of DDP significantly decreased expression of YAP target genes of CTGF and Cyr61 in A549 cells

The mRNA and protein expression of CTGF and Cyr61 were analyzed by RT-PCR (A) and Western blot (C) in A549 cells; B, D: The quantified results of A and C.**P<0.01vscontrol group.

参考文献：

[1] Wang G, Lu X, Dey P, et al.Targeting YAP-dependent MDSC infiltration impairs tumor progression[J].CancerDiscov, 2016,6(1): 80-95.

[2] Wang J, Xiao Y, Hsu C W, et al.Yap and Taz play a crucial role in neural crest-derived craniofacial development[J].Development, 2016,143(3): 504-15.

[3] Lau A N, Curtis S J, Fillmore C M, et al.Tumor-propagating cells and Yap/Taz activity contribute to lung tumor progression and metastasis[J].EMBOJ, 2014,33(5): 468-81.

[4] Singh A, Ramesh S, Cibi D M, et al.Hippo signaling mediators Yap and Taz are required in the epicardium for coronary vasculature development[J].CellRep, 2016,15(7): 1384-93.

[5] Li S, Zhang X, Zhang R, et al.Hippo pathway contributes to cisplatin resistant-induced EMT in nasopharyngeal carcinoma cells[J].CellCycle, 2017,16(17): 1601-10.

[6] Yang C, Tan J, Zhu J, et al.YAP promotes tumorigenesis and cisplatin resistance in neuroblastoma[J].Oncotarget, 2017,8(23): 37154-63.

[7] Qin X, Yu S, Xu X, et al.Comparative analysis of microRNA expression profiles between A549, A549/DDP and their respective exosomes[J].Oncotarget, 2017,8(26): 42125-35.

[8] Shi L, Xu Z, Wu G, et al.Up-regulation of miR-146a increases the sensitivity of non-small cell lung cancer to DDP by downregulating cyclin J[J].BMCCancer, 2017,17(1): 138.

[9] 饶进军,何关生,毛 楠, 等.沉默EZH2表达逆转人非小细胞肺癌顺铂耐药性[J].中国药理学通报, 2014,30(8): 1084-90.

[9] Rao J J, He G S, Mao N, et al.Reverse effect of silencing EZH2 expression on human cisplatin resistant non-small cell lung cancer[J].ChinPharmacolBull, 2014,30(8): 1084-90.

[10] 姚圆圆, 郝吉庆.PJ34对肺腺癌顺铂耐药细胞增殖及耐药性的影响[J].中国药理学通报, 2015,31(6): 865-70.

[10] Yao Y Y, Hao J Q.Study of reversal effect of PARP-1 inhibitor PJ34 on cisplatin resistance in human lung adenocarcinoma cells[J].ChinPharmacolBull, 2015,31(6): 865-70.

[11] Zhao L, Yang G, Bai H, et al.NCTD promotes Birinapant-mediated anticancer activity in breast cancer cells by downregulation of c-FLIP[J].Oncotarget, 2017,8(16): 26886-95.

[12] Zhang J, Shen D, Jia M, et al.The targeting effect of Hm2E8b-NCTD-liposomes on B-lineage leukaemia stem cells is associated with the HLF-SLUG axis[J].JDrugTarget, 2018,26(1): 55-65.

[13] 李 尧, 岳志强, 陶 丽, 等.去甲斑蝥素抑制B16F10黑色素瘤肺转移的研究[J].中国药理学通报, 2013,29(10): 1404-8.

[13] Li Y, Yue Z Q, Tao L, et al.Effect of norcantharidin on melanoma metastasis induced by Urokinase type plasminogen activator[J].ChinPharmacolBull, 2013,29(10): 1404-8.

[14] Guo J, Wu Y, Yang L, et al.Repression of YAP by NCTD disrupts NSCLC progression[J].Oncotarget, 2017,8(2): 2307-19.