陈俊生,董 琪,曹玉祥,吴志浩
(1.皖南医学院 麻醉学院,安徽 芜湖 241002;2.皖南医学院 精准医学兴趣小组,芜湖 安徽 241002;3.皖南医学院 临床医学院,安徽 芜湖 241002;4.安徽师范大学 生命科学学院,安徽 芜湖 241000;5.皖南医学院 细胞生物学教研室,生物活性大分子重点实验室,安徽 芜湖 241002)
烟草的使用是全世界主要的公共卫生问题,与烟草有关的癌症每年造成数百万人死亡,其中肺癌患者占绝大多数[1]。4-甲基亚硝胺基-1-3-吡啶基-1-丁酮(4-methylnitrosamino-1-3-pyridyl-1-butanone,NNK)是烟草中重要的致癌物质,其在体内可被代谢为强致癌物4-羟基-1-(3-吡啶基)-1-丁酮[2]。在细胞中发生了这些复杂的生化反应的结果是NNK广泛地诱导DNA损伤[3-5]。
毛细血管扩张-共济失调突变基因(Ataxia-telangiectasia mutated,ATM) 定位于染色体11q22-23,长度为13 kb,其中含有66个外显子,编码一个13 kb长度的mRNA。其编码产物为ATM蛋白,属于一种丝/苏氨酸蛋白激酶,含有3056个氨基酸残基,是一种分子质量为350 ku大分子量蛋白,ATM是磷脂酰肌醇激酶相关激酶(PIKK)家族的成员,其在DNA双链断裂(DSB)诱导的信号传导中起主要作用[6-7]。在细胞受到DNA双链损伤时,它能被磷酸化激活并启动双链修复阻止细胞周期的进程[4]。因此,研究其活性调控及蛋白表达的机制具有重要的临床意义。目前关于ATM基因表达的相关机制还尚未明确,为了后续探究ATM信号转导的相关分子机制,我们构建了人源ATM基因启动子荧光素酶报告基因质粒,并对其活性进行初步研究。
1.1 材料 人非小细胞肺癌细胞H1299为本实验室冻存;DMEM培养基(HyClone公司);小牛血清(南京博全科技有限公司);polyjet(SignaGen公司);E.coli DH5α Competent Cells(TaKaRa 公司);双荧光素酶报告基因检测试剂盒、PGL3-Basic 质粒(Promega公司);T4 DNA连接酶、KpnⅠ和NheⅠ(NEWENGLAND BioLabs);p-ATM、ATM和β-actin抗体以及二抗(CST公司);DNA Maker、质粒小量提取试剂盒(碧云天公司);质粒中提试剂盒(QIAGEN公司);基因组DNA提取试剂盒和Taq PCR MasterMix(TIANGEN公司);显影液(MILLIPORE公司)。
1.2 方法
1.2.1 蛋白质免疫印迹法(Western Blot)检测ATM蛋白的表达量 适量的细胞接种于六孔板中,用含10%小牛血清的DMEM培养基培养,待长满后以DMEM饥饿12 h,再以1 μmol/L的NNK不同时间段处理(浓度为本实验室前期探索[8]),4 h后收样。在SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳凝胶上分离,转膜后,用脱脂牛奶封闭1 h,然后用一抗过夜孵育,再以二抗孵育1 h,最后涂以适量显影液进行成像。
1.2.2 ATM启动子的克隆 H1299细胞培养于含10%小牛血清的DMEM培养基中。待长满后,用基因组DNA提取试剂盒制备H1299细胞基因组DNA,具体步骤按照操作手册进行。通过UCSC网站,找到人ATM基因启动子序列,设计出一对引物,上游为5′-CCGGTACCCCTGACAGACAAGTGACCCACAAACA-3′,下游为5′-CTAGCTAGCAGAAGCAACGCCAAGCAGCCGCAGAGC-3′。以提取的H1299细胞基因组DNA为模板,PCR条件:预变性94℃、3 min;变性94℃、30 s,退火60℃、30 s,延伸72℃、60 s,共30个循环,延伸72℃、5 min,扩增后的产物经1%的琼脂糖凝胶电泳进行分析。将上述克隆的ATM启动子片段和PGL3-Basic分别经KpnⅠ、NheⅠ双酶切、连接,然后进行转化,挑取单克隆菌落做菌落PCR鉴定其阳性的克隆,然后阳性的克隆再次进行摇菌,保种后进行质粒提取、酶切并送往上海生工生物工程有限公司测序。
1.2.3 利用GraphPad Prism 6软件对实验中的数据进行t检验,P<0.05为差异有统计学意义。
2.1 ATM启动子克隆成功 将扩增产物经1%的琼脂糖凝胶电泳进行分析,出现了预估的条带,说明扩增成功(图1A)。将构建好的质粒进行KpnⅠ、NheⅠ双酶切,出现了两条带,分别与载体和片段的分子量相同(图1B),上海生工生物工程有限公司的测序结果更加说明了ATM启动子克隆成功。
A:1.PCR扩增产物,M.DNA Maker DL2000。
B:1.所构建质粒的酶切产物,M.DNA Maker DL5000。
图1 琼脂糖凝胶电泳检测结果
2.2 NNK对于ATM蛋白的表达有抑制作用 用1 μmol/L的NNK以不同时间段处理H1299细胞,我们发现随着时间的增加,NNK对于ATM的抑制逐渐增强而NNK在3 h和6 h增加了p-ATM的活性,之后随着时间的增加p-ATM的活性减弱,这可能是因为NNK抑制ATM的总蛋白表达量,继而影响到p-ATM的量(图2)。
1 μmol/L的NNK以不同时间段处理的H1299细胞中ATM与p-ATM的表达量。
图2 Western Blot检测结果
2.3 NNK在转录水平上抑制ATM基因的表达 将构建的ATM启动子报告基因转入H1299细胞中,以1 μmol/L的NNK处理4 h,结果显示NNK抑制ATM启动子的活性(图3)。
Control:0.7380 ± 0.0594,n=3;1 μmol/L NNK:0.5015 ± 0.0147,n=3;t=3.865,P=0.0289,差异具有统计学意义。
图3 双荧光素酶报告基因检测系统检测H1299细胞中NNK对ATM启动子活性的影响
我国属于肺癌多发国,多达90%的肺癌可归因于吸烟或二手烟,其中烟草致癌物质NNK已被国际癌症研究机构列为第1类人体致癌物质,吸烟导致肺癌的现状不容乐观。NNK已在体内外的实验中被证明和肺癌的发生与发展密切相关。在动物模型中,NNK是唯一系统诱导小鼠、大鼠以及仓鼠肺部肿瘤的强致癌物。NNK是来源于烟草加工过程中所产生的亚硝胺类物质。在体内,经过细胞色素p450的作用导致了NNK的羟基化,产生了4-羟基-1-(3-吡啶基)-1-丁酮(HPB),促进了DNA加合物的生成,进而会导致核苷酸的替代、缺失或染色体的重排[9-10]。NNK不仅诱导了DNA的突变,同时可以影响细胞内多种信号通路。研究表明,EGFR、AKT、MAPK、NF-κB 等细胞内重要的信号转导途径都可以被NNK所激活[9]。我们实验室前期的工作发现,NNK可以和尼古丁乙酰胆碱受体结合诱导AKT和ERK1/2信号通路,进而诱导缺氧诱导因子HIF-1α的表达[8,10]。由NNK诱导的DNA突变及染色体变化无疑会导致DNA损伤修复的激活。这与我们发现的p-ATM在NNK处理早期呈上升趋势的结果一致。ATM在细胞内与NBS1以及BRCA1形成BRSC复合物(BRCA1-Associated Genome Surveillance Complex)起到监视DNA损伤的作用。当DNA受到损伤时,ATM蛋白激酶会被磷酸化激活,激活的ATM蛋白激酶会激活下游一系列控制细胞周期的蛋白底物,如p53、chek2、chek1、Nhb1等,以此来使细胞周期停滞,为DNA损伤的修复赢得时间[11]。因此,ATM在修复NNK诱导的DNA损伤中起到关键作用。我们的研究发现,NNK抑制ATM蛋白表达呈时间依赖性,同时我们发现NNK可以在转录水平上抑制ATM启动子的活性。根据本实验室及国内外其他实验室工作的结果,我们推测NNK有可能影响了某个信号通路的功能进而抑制了ATM蛋白的表达,其具体分子机制目前正在加紧研究中。
本项研究证实了NNK对ATM总蛋白的表达有抑制作用,这有可能导致大范围的DNA损伤不能被修复,因此,我们认为NNK抑制ATM是肺癌发生发展的可能机制之一。本实验为探究NNK在非小细胞肺癌细胞中有关ATM信号通路的分子机制奠定了基础,进一步探究NNK对ATM活性及表达的调节对了解烟草如何诱导肺癌的发生具有重要意义,若能更清楚地了解ATM基因和ATM蛋白的功能,可为ATM作为治疗吸烟所致肺癌的新靶点提供更准确可靠的理论依据。
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