B303亚型的血型分子机制及临床输血分析

华琳，贺云蕾，俞露，郭雯玉，许德义，邓刚

ABO血型系统中，除了A、B、O、AB 4种常见表型外，在人群中还存在一些少见的ABO亚型。实际工作中时常会遇到正反定型不相符的现象，其中较大一部分则是由于亚型的原因引起，正确鉴定红细胞血型是确保临床安全用血的关键[1]。本文对1例B303亚型患者的临床输血情况进行分析，报道如下。

1 资料与方法

1.1 一般资料 1例女性患者因外伤做手术，术前配血时发现ABO血型正反定型不符合，故医院将患者血液标本送到本实验室。

1.2 血型血清学检测 血清学正反定型及吸收放散试验均按常规方法操作。主要试剂有：单克隆抗-A、抗-B及反定型红细胞（上海血液生物医药有限责任公司），人源抗-A、抗-B抗体（自制），抗-AB、抗-H抗体（荷兰sanquin公司）。

1.3 序列特异性引物聚合酶链反应（PCR-SSP）进行ABO血型基因分型采用RelaxGene Blood DNA System（北京TIANGEN公司）提取样本DNA，具体操作按试剂说明进行。采用ABO血型基因分型试剂盒Ready Gene ABO（德国inno-train公司）进行PCR-SSP分型。

1.4 ABO基因测序分析 按照参考文献[2-3]中的引物及扩增体系，对ABO基因7个外显子及其邻近内含子区分别扩增后送测序公司（上海桑尼测序有限公司）测序。Taq酶购自上海Promega公司，PCR仪为Veriti96Well Thermal Cycler（美国，AB公司），反应总体积50 l。1.5 PCR产物克隆测序 将3、6、7外显子的PCR产物纯化并克隆入pMD8-T载体（TaKaRa公司）后，送公司测序（上海桑尼测序有限公司）。

2 结果

2.1 血清学检查结果 根据血清学结果，初步判断患者为B亚型。见表1。

2.2 PCR-SSP检测结果 根据试剂盒说明书，内参产物片段大小为434 bp，各泳道的特异性阳性条带DNA分子量大小分别为 1（134 bp）、2（133 bp）、3（194 bp）、4（193 bp）、5（195 bp）、6（194 bp）、7（170 bp）、8（170 bp）。先证者电泳图中第3和7泳道未出现阳性条带，对照试剂盒说明书可判定基因型为O/B型（封三彩图 7）。

2.3 ABO基因测序分析 患者ABO基因的第1～5外显子未发现任何突变，但第6外显子的261位为G缺失，297位A＞G纯合突变。第7外显子上存在：526G/C、657T/C、703G/A、796C/A、803G/C、930G/A、646T/A、681G/A、771T/C、829A/G杂合。分析邻近外显子的内含子区域，发现第 3内含子存在IVS+5G＞A杂合突变（封三彩图8）。2.4 单体型序列分析 对患者标本进行TA克隆后测序发现，一条单体型为常见的O20，而另一条单体型与B101相比，存在IVS3+5G＞A杂合突变，此突变可引起异常剪切，影响D-半乳糖转移酶（GTB）正常表达。经检索血型抗原基因突变数据库BGMUT，患者基因型为B303/O20。见封三彩图8。

3 讨论

ABO血型系统具有重要的临床意义，可引起溶血性输血反应和新生儿溶血病。ABO基因的直接编码产物是2个糖基转移酶，N-乙酰氨基半乳糖转移酶（GTA）和GTB。通过这2个酶的催化作用，在红细胞膜的H前体糖链上分别添加2个不同的单糖基团，并分别形成A或B抗原，可见转移酶是抗原形成的关键[4]。B3亚型是ABO血型一种较为常见的弱表现型，其血清学最主要特点是B3细胞与相应抗体出现混合视野外观。已证实 ABO血型系统不同的亚型是由于基因水平上核苷酸变化所引起的，其突变范围涉及7个外显子和部分内含子区域，包括缺失、插入和点突变[5-6]。

表1 先证者及家系血清学检查结果

本例患者血清学特点是正定抗-B出现混合凝集，反定存在冷反应性抗-B抗体，符合B3亚型的特征。测序结果表明，与B101序列相比，患者有一条等位基因第1～7外显子与正常GTB基因一致，仅在第3内含子发生IVS3+5G＞A杂合突变，此突变可影响剪接供体，使其发生异常剪切，RNA加工时第3外显子被直接跳过，导致该基因的转录本中没有第3外显子，翻译产物中缺乏19个氨基酸，影响GTB正常表达，可能导致GTB酶的活性或特异性改变，导致B抗原数量或特异性的改变，属于比较少见的B303亚型。Yu等[7]最早对B303亚型进行了报道。目前发现的B3等位基因己有 16种[8]，其中12例（B301、B302、B304、B305、B306、B307、B308、B309、B310、B313、B315、B316）为外显子上的点突变导致不同的氨基酸改变，1例（B314）为第1外显子上碱基缺失导致移码突变，2例（B311、B312）为起始密码子上游调控区域碱基缺失或突变。而B303等位基因则与上述3个B3等位基因有发生机制所不同，是由于内含子突变导致的剪切异常而形成。

ABO亚型的血液，由于抗原与抗体共存，在临床使用过程中往往表现为血型定型和配血困难。由于各种原因，B亚型往往被误定为O型，误定为O型的B亚型患者，若输注了O型血液；或误定为O型的B亚型献血者的血液，输注给O型患者，常常会出现输血反应。本例患者由于是B亚型，临床输血时使用洗涤O型红细胞及AB型血浆，输注O型洗涤红细胞虽然相对安全，但毕竟为异型血，仍要控制输血速度，并控制单次输血量和输血间隔时间，同时也要严格做好围术期的血液管理，减少自体血液的丢失和异体血的输入。综合上述措施，本例患者取得了不错输血效果。

参考文献：

[1] Hult AK,Yazer MH,Jorgensen R,et al.Weak a phenotyes associated with novel ABOallelescarryingthe A2-related 1061C deletion and various missense substitutions[J].Transfusion,2010,50(7)：1471-1486.

[2] Zhu F,Tao S,Xu X,et al.Distribution of ABOblood group alleleand identification of three novel alleles in the Chinese Han population[J].Vox Sang,2010,98(4)：554-559.

[3] 洪小英,应燕玲,许先国,等.一例ABO亚型ABx09的分子生物学研究和鉴定[J].中华医学遗传学杂志,2011,28(5)：548-551.

[4] Freyburger G,Trillaud H,Labrouche S,et al.D-dimer strategy inthrombosisexclusiona gold standard study in 100 patients suspected of deep venous thrombosis or pulmonary embolism：8 DD methods compared[J].Thrombosis&Haemostasis,1998,79(1)：32-37.

[5] Blumenfeld OO,Patnaik SK.Allelic genes of blood group antigens：a source of human mutations and cSUPs documented in the Blood Group Antigen Gene Mutation Database[J].Human Mutation,2004,23(1)：8-16.

[6] Daniels G.Human blood groups[M].2nd ed.Oxford：Black well science,2002：17-59.

[7]Yu LC,Twu YC,Chou ML,etal.Molecular genetic analysis for the B(3)allele[J].Blood,2002,100(4)：1490-1492.

[8]Patnaik SK,Helmberg W,Blumenfeld OO.BGMUT database of allelic variants of genesencodinghumanblood group antigens[J].Transfus Med Hemother,2014,41(5)：346-351.