总氨态氮对菲律宾蛤仔早期生长发育的影响

韩天坤， 杨凤、2， 贾甲， 李晓旭， 闫喜武、2

(1.大连海洋大学水产与生命学院，辽宁大连116023；2.辽宁省贝类良种繁育工程技术研究中心，辽宁大连116023)

菲律宾蛤仔Ruditapes philippinarum隶属于软体动物门Mollusca、双壳纲Bivalvia、帘形目Veneroida、帘蛤科 Veneridae、蛤仔属 Ruditapes，是世界性养殖贝类，也是中国单种产量最高的养殖贝类。目前，国内外关于菲律宾蛤仔的研究主要集中在繁殖生物学[1－3]、 养殖技术与工艺[4]、养殖生态学[5－8]和遗传育种[9－10]等方面， 而关于总氨态氮(TAN)对菲律宾蛤仔的影响研究尚未见报道。

TAN是养殖生产中最容易积累的有毒物质，关于TAN与贝类关系的研究已有报道。Ferretti等[11]研究表明，在pH为 (8.14±0.06)、温度为(19.7±0.4)℃、盐度为 (31.0±0.5) 条件下，海水中的氨对蛤蜊Spisula solidissima幼虫的48 h LC50为10.6 mg/L(非离子氨浓度为0.53 mg/L)。杨凤等[12]研究表明，在 pH为 7.63、7.98、8.34、8.74时，总氨对海湾扇贝Argopecten irradians幼贝的 96 h LC50依次为 20.01、 11.85、 3.32、 0.55 mg/L。师尚丽等[13]和罗杰等[14]的研究表明，随着盐度的降低和pH的升高，氨氮对方斑东方螺Babylonia areolata和管角螺Hemifusus tuba稚贝的毒性增强。栾红兵等[15]研究表明，氨氮浓度达到0.14 mg/L时，不影响海湾扇贝幼体发育。谭烨辉等[16]研究表明，在皱纹盘鲍用水和养鲍自污染水中，非离子氨浓度分别低于0.035、0.010 mg/L时，对皱纹盘鲍生长无影响。Reddy－Lopata等[17]研究表明，氨对南非鲍鱼Haliotis midae Linnaeus存活和生长都具有负面影响。Wang等[18]研究表明，温度和氨浓度对近江牡蛎Crassostrea ariakensis受精率和孵化率的二次效应极显著。吕永林等[19]研究表明，随着温度的升高，氨氮对泥蚶Tegillarca granosa的毒性增强。上述研究结果均表明，氨态氮对贝类的毒性受盐度、pH和温度的影响。

本研究中，研究了菲律宾蛤仔受精卵至稚贝阶段 (室内培育阶段)对TAN的耐受性，以期为建立和完善菲律宾蛤仔室内人工育苗水质指标及改进育苗技术提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 材料

试验用菲律宾蛤仔 (以下简称蛤仔)的受精卵、浮游阶段和稚贝阶段的幼体均由大连市庄河贝类养殖场育苗场提供。用于人工催产的亲贝壳长为(3.32±2.6)cm，壳高为 (2.09±0.3)cm，体质量为 (7.78±2.7)g。

1.2 方法

在预试验基础上按等对数间距设置TAN浓度梯度，以不加NH4Cl(分析纯)的天然海水作为对照。试验用水为沙滤海水，全部试验均在2.5 L聚乙烯桶中进行，用恒温加热棒水浴控温。试验期间，用pHS－3C型数字酸度计测定pH，采用奈氏试剂法测定TAN浓度，采用重氮－偶氮比色法测定亚硝酸盐含量。试验水温为21～24℃，pH为7.9～8.3，盐度为 27～30，亚硝酸盐为 0.02～0.07 mg/L。孵化期、浮游期和稚贝期TAN毒性试验中TAN的实际浓度如表1所示。

表1 孵化期、浮游期和稚贝期毒性试验中TAN的浓度Tab.1 Experimental contents of TAN during incubation，pelagic stage and juvenile in Manila clam Ruditapes philippinarum mg/L

1.2.1 孵化阶段毒性试验 试验设7个试验组和1个对照组 (表1)，每组设3个重复，每个浓度组受精卵密度为80个/mL。试验期间，白天搅水夜间充气，整个过程不投饵。24 h后测定D形幼虫密度，同时测定换水前后TAN、亚硝酸盐含量和pH，并按下式计算孵化率和畸形率:

1.2.2 浮游阶段毒性试验 试验设6个试验组和1个对照组 (表1)，每组设3个重复，每个浓度组中放入刚孵化的壳长为 (103.2±3.0)μm的D形幼虫，密度为4～5个/mL，试验密度以放入后实测值为准。每24 h全量换水1次，每天投饵4次，前期每天投喂等鞭金藻5000 cells/mL，后期每天逐步增至 40 000 cells/mL。在24、48、72、96 h时，测定D形幼虫的密度和壳长，同时测定换水前后TAN、亚硝酸盐含量和pH。以试验期间TAN浓度和pH的平均值作为试验和计算非离子氨(UIA)的真实值。相关计算公式为

1.2.3 稚贝阶段毒性试验 试验设7个试验组和1个对照组 (表1)，每组设3个重复，每个浓度组放入壳长为(318.1±27.3)μm、壳高为 (291.0±41.1)μm的试验稚贝，密度为120个/L，每24 h全量换水1次，每天投饵2次，按水体积的1%混合投喂金藻、新月菱形藻和小球藻。96 h后测定稚贝存活率和壳长、壳高，同时测定换水前后TAN、亚硝酸盐含量和pH。存活率、相对生长和校正死亡率的计算同 “1.2.2”节。

1.3 数据处理

用概率单位法求半致死浓度LC50和LC5(死亡率为5%时的TAN浓度)，当数据不符合概率单位法的基本原理时，选择50%死亡率附近的浓度，用直线内插法求LC50[20]。设定对观测指标 (孵化率、相对生长)产生5%负面影响的TAN浓度为无影响的TAN有效浓度 (EC5)，根据观测指标与TAN浓度的关系曲线求5%有效浓度EC5和半数有效浓度EC50(使观测指标下降5%或50%所对应的TAN浓度)。

非离子氨含量ρNH3－N按下式计算:

2 结果与分析

2.1 TAN对蛤仔孵化率和初孵D形幼虫畸形率的影响

从图1可见，在pH为 (8.28±0.03)、盐度为30、水温为 (22.6±1.2)℃时，TAN≤29.5 mg/L(UIA≤2.03 mg/L)条件下，蛤仔受精卵均可孵化出D形幼虫，但是随着TAN浓度的逐渐升高，其孵化率逐渐下降，畸形率逐渐升高。

回归分析表明，TAN浓度的常用对数 (x)与孵化率 (yf)呈极显著负相关 (图2)，回归方程为

图1 TAN对菲律宾蛤仔孵化率和畸形率的影响Fig.1 Effect of TAN on hatching rate and deformityrate in Manila clam Ruditapes philippinarum

把对照组的孵化率按100%计算，由回归方程求得TAN对蛤仔孵化率的24 h EC5为1.89 mg/L(UIA浓度为0.13 mg/L)，24 h EC50为7.29 mg/L(UIA浓度为0.502 mg/L)。

回归分析表明，TAN浓度的常用对数 (x)与畸形率 (yj)呈极显著直线正相关 (图2)，回归方程为

把对照组的畸形率按0%计算，由回归方程求得TAN对蛤仔畸形率的24 h EC5为0.316 mg/L(UIA浓度为0.022 mg/L)。计算得24 h EC50浓度较大，孵化时期一般达不到此浓度，故在此不进行讨论。

图2 TAN浓度对数与菲律宾蛤仔孵化率和畸形率的关系Fig.2 Relationship between the logarithm of TAN concentration and hatching rate and deformity rate in Manila clam Ruditapes philippinarum

2.2 TAN对浮游期幼虫死亡率和生长的影响

2.2.1 对浮游期幼虫死亡率的影响 从图3可见:水温为 (22.0±0.2)℃、盐度为27、pH为 (7.9±0.09)条件下胁迫96 h时，TAN为29.3 mg/L浓度组的D形幼虫100%死亡；当TAN≤11.8 mg/L时，各试验组均有幼虫存活，而TAN浓度为0.055 mg/L(UIA浓度为0.001 mg/L)和0.334 mg/L(UIA浓度为0.009 mg/L)组的幼虫平均死亡率为0；当TAN≥4.72 mg/L(UIA≥0.126 mg/L)时，死亡率随TAN浓度的升高而直线上升。

由直线内插法求得TAN对D形幼虫死亡率的24、 48、 72、 96 h LC50依次为 17.0、 15.8、 10.2、7.94 mg/L，相应的 UIA浓度分别为 0.454、0.422、 0.272、 0.212 mg/L。

图3 不同TAN浓度下D形幼虫的死亡率Fig.3 Mortality of D－larval Manila clam Ruditapes philippinarum exposed to various TAN concentrations

2.2.2 对浮游期幼虫相对生长的影响 从图4可见:当TAN≤0.784 mg/L时，对浮游期幼虫相对生长没有影响，甚至比对照组还高；当TAN浓度为0.784～29.3 mg/L时，随着TAN浓度的增加，相对生长减慢。在浓度为0.784～29.3 mg/L范围内线性回归表明，24、48、72、96 h的相对生长与TAN浓度的常用对数均呈显著直线相关 (表4)。

取TAN浓度为0.055、0.334、0.784 mg/L组相对生长的平均值为100%，根据回归方程 (表4)求得 24 h EC5、 48 h EC5、 72 h EC5和 96 h EC5依次为3.22、1.20、1.84、3.16 mg/L，相应的 UIA浓度分别为0.086、 0.032、0.049、0.084 mg/L。

图4 不同TAN浓度下菲律宾蛤仔D形幼虫的相对生长Fig.4 Relative growth of D－larval Manila clam Ruditapes philippinarum exposed to different TAN concentrations

表4 菲律宾蛤仔D形幼虫相对生长 (yt)与TAN浓度对数 (lg x)的回归方程参数及EC5Tab.4 Parameters of logarithmic regression equation between relative growth(yt)and TAN(lg x)concentrations and effective concentration(EC5)for D－larval Manila clam Ruditapes philippinarum

2.3 TAN对稚贝的急性毒性分析

2.3.1 对稚贝死亡率的影响 从图5可见:在pH为 (8.13±0.04)、盐度为 30、水温为 (20.5±1.22)℃条件下胁迫96 h时，随着TAN浓度的升高稚贝死亡率升高；当TAN≤9.76 mg/L(UIA≤0.418 mg/L)时，对稚贝死亡无明显影响；当TAN≥14.5 mg/L(UIA≥0.623 mg/L)时，随着TAN浓度的增加稚贝死亡率增加。

由概率单位法求得TAN对稚贝死亡率的96 h LC5为9.62 mg/L(UIA浓度为0.412 mg/L)，96 h LC50为49.0 mg/L(UIA浓度为2.10 mg/L)(图6)。

图5 不同TAN浓度下菲律宾蛤仔稚贝的死亡率Fig.5 Mortality of juvenile Manila clam Ruditapes philippinarum exposed to various TAN concentrations

图6 TAN浓度对数与菲律宾蛤仔稚贝死亡率概率单位的关系Fig.6 Relationship between the logarithm of TAN concentrations and the probability unit of juvenile Manila clam Ruditapes philippinarum

2.3.2 对稚贝相对生长的影响 从图7可见:胁迫96 h时，各个试验组稚贝的壳长相对生长均低于对照组；当 TAN≤14.5 mg/L(UIA≤0.623 mg/L)时，壳长相对生长呈直线下降；当TAN≥21.7 mg/L(UIA≥0.928 mg/L)时，稚贝相对生长无明显规律，甚至为负生长。

图7 不同TAN浓度下菲律宾蛤仔稚贝壳长的相对生长Fig.7 Relative growth of shell length of juvenile Manila clam Ruditapes philippinarum exposed to different TAN concentrations

将对照组的壳长相对生长校正为100%，在TAN浓度14.5 mg/L(UIA浓度为0.623 mg/L)以下，以TAN的浓度对数与壳长相对生长作回归(图8)，得到回归方程为

由回归方程求得TAN对稚贝壳长相对生长的96 h EC5为0.45 mg/L(UIA浓度为0.019 mg/L)，96 h EC50为4.9 mg/L(UIA浓度为0.21 mg/L)。

从图9可见:各试验组的壳高相对生长均低于对照组；当TAN≤21.7 mg/L(UIA≤0.928 mg/L)时，稚贝壳高相对生长呈直线下降；当 TAN≥31.4 mg/L(UIA≥1.35 mg/L)时，稚贝壳高相对生长无明显规律。

将对照组的壳高相对生长校正为100%，在TAN浓度为21.7 mg/L(UIA浓度为0.928 mg/L)以下时，以TAN的浓度对数 (x)与壳高 (yg)的相对生长作回归，得到回归方程为

由回归方程求得TAN对稚贝壳高相对生长的96 h EC5为0.508 mg/L(UIA浓度为0.022 mg/L)，96 h EC50为10.5 mg/L(UIA浓度为0.448 mg/L)。

图8 TAN浓度对数与菲律宾蛤仔稚贝壳长相对生长的关系Fig.8 Relationship between the logarithm of TAN concentration and relative growth of shell length of juvenile Manila clam Ruditapes philippinarum

图9 不同TAN浓度下菲律宾蛤仔稚贝壳高的相对生长Fig.9 Relative growth of shell height of juveniles of Manila clam Ruditapes philippinarum at different TAN concentrations

图10 TAN浓度对数与菲律宾蛤仔稚贝壳高相对生长的关系Fig.10 Relationship between the logarithm of TAN concentration and relative growth of shell height of juvenile Manila clam Ruditapes philippinarum

3 讨论

3.1 总氨态氮对菲律宾蛤仔幼体发育和生长的影响

本试验结果表明，随着TAN浓度的升高，蛤仔的畸形率 (图1、图2)、D形幼虫死亡率 (图3)和稚贝死亡率 (图5、图6)呈上升趋势，而孵化率 (图1、图2)、D形幼虫相对生长 (图4)及稚贝的相对生长 (图7～图10)呈下降趋势。但在不同阶段，蛤仔对TAN的耐受力不同。不同时期蛤仔对TAN耐受力的比较见表5。

通常用半致死浓度LC50和半数有效浓度EC50来比较试验生物对毒物的耐受能力，因为LC50和EC50能够较好地消除个体差异对毒物毒性的反应[20]。由表5可知，非离子氨对D形幼虫的96 h LC50(0.212 mg/L)＜对孵化率的24 h EC50(0.502 mg/L) ＜对稚贝的96 h LC50(2.10 mg/L)。说明浮游期对TAN最敏感，稚贝阶段对TAN的耐受性最强。这一结论与袁洪梅等[21]对海湾扇贝的研究结果相似。其原因可能是与营浮游生活的D形幼虫相比，稚贝有更加坚固的贝壳保护，并且经过变态发育后体内各个器官发育更加完善，从而提高了机体对TAN的耐受力。而受精卵有卵膜保护，并且孵化期只有24 h，胁迫时间较短。因此，在蛤仔育苗期间，注意调控和保持浮游期水质在良好状态，将有利于提高蛤仔苗种培育的成活率。

从稚贝阶段相对生长的EC5和EC50可以看出，TAN对壳长生长的影响比对壳高生长影响要大，具体原因还有待于进一步研究。

浮游期高浓度组 (≥4.72 mg/L)72 h和96 h的相对生长较24 h和48 h时异常升高 (图4)，原因可能是，随着胁迫时间的延长，高浓度组的D形幼虫死亡率高、密度小，每个个体获得饵料量较低浓度组多，相对空间更大，导致高浓度组存活下来的幼体生长速度可能比低浓度组更快。而稚贝阶段的壳长相对生长在高浓度组出现了负增长 (图7)，原因可能是高浓度组的TAN胁迫导致稚贝没有生长，并且较大个体中毒死亡所致。

3.2 菲律宾蛤仔对TAN耐受能力与其他贝类比较

关于贝类受精卵、D形幼虫和稚贝对TAN的耐受性研究报道较少。与其他学者的研究进行比较结果发现:蛤仔在浮游阶段 (壳长0.103 mm)对非离子氨的耐受能力较壳长为0.103～0.245 mm的海湾扇贝[21]强；蛤仔在稚贝阶段 (壳长 0.318 mm)对非离子氨的耐受能力比魁蚶 (壳长2.01 mm)[22]、橄榄蚶 (壳长2.72 mm)[23]弱，但比美国牡蛎 (壳长13～17 mm)[24]、日本海神蛤 (壳长10 mm)[25]、海湾扇贝 (壳长10～15 mm)[12]和毛蚶[26](壳长1.58 mm) 强 (表6)。

表5 菲律宾蛤仔幼体不同发育阶段对TAN的耐受性比较Tab.5 Tolerance of larval Manila clam Ruditapes philippinarum to TAN at different developmental stages mg/L

表6 TAN对几种贝类的96 h LC50的比较Tab.6 Comparison of 96 h LC50of TAN with other molluscs

3.3 菲律宾蛤仔育苗用水中总氨态氮的安全浓度

毒物的安全浓度是指对特定生物整个生活史均没有影响的浓度，可以依据96 h LC50×f计算得到，其中f为系数[20]。对于容易降解的有毒物质 (如TAN)，f值可取0.1[20]。由此，根据D形幼虫的96 h LC50(表5)计算得到非离子氨的安全浓度为0.021 mg/L，根据稚贝的96 h LC50(表5)计算得到非离子氨的安全浓度为0.210 mg/L。可见，用不同发育阶段的受试生物进行毒性试验所得安全浓度不同。从严控制水质的话，根据最敏感的D形幼虫阶段试验结果，可以计算得到其非离子氨的安全浓度为0.021 mg/L，该值接近渔业水质标准规定的0.020 mg/L[27]。综合各个阶段的EC5和EC50，建议蛤仔育苗期间浮游期非离子氨浓度控制在0.020 mg/L以下为好 (pH＜8.5时，TAN＜0.200 mg/L)，稚贝阶段非离子氨浓度控制在0.030 mg/L以下为好 (pH＜8.5时，TAN＜0.700 mg/L)。

在蛤仔苗种生产中TAN的主要来源是残饵和排泄物的分解，所以要适量投喂新鲜优质饵料。由于高pH条件下氨态氮的毒性增强，所以要经常监测pH和氨态氮的含量，避免高pH时氨态氮中毒。本研究中所得结论为完善菲律宾蛤仔生态学及育苗期间的水质调控技术提供了参考。

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