糙皮侧耳液体发酵产木聚糖酶的条件优化

王萌萌，黄 亮，张 怡，班立桐

（天津农学院 农学与资源环境学院，天津 300384）

糙皮侧耳（Pleurotus ostreatus），俗称平菇，属伞菌目、担子菌亚门、侧耳属，肉质肥厚、口感佳，适应性强，分布范围广，是我国产量第一的食用菌品种[1]。平菇富含营养和药用成份，在医疗保健上应用范围很广[2]。研究发现平菇具有很强的纤维素、木质素降解能力，生物学效率高[3]。利用食用菌降解秸秆等农业废弃物既经济又环保，近年来受到越来越广泛的重视。

玉米秸秆中富含纤维素、半纤维素和一定数量的木质素，是一种可以资源化利用的固体有机废弃物[4]。半纤维素大约占植物干重的1/3左右，它与纤维素严密连接构成了细胞壁的主体结构，是自然界中除纤维素外含量最丰富的非淀粉类多糖[5-6]。木聚糖是一种结构复杂的多聚五碳糖，是半纤维素的重要组成成分；木聚糖酶（Xylanase）是指将木聚糖降解成低聚糖和木糖的水解酶，是木聚糖降解酶系中最关键的酶[7]。由于木聚糖酶具有多样性和催化特性，使得该酶近年来在饲料、食品、造纸、纺织、能源等领域的应用日益广泛，也因此越来越受到科研工作者的关注。本文探讨利用农业废弃物中的玉米秸秆作为主要原料，以平菇进行液体发酵生产木聚糖酶，并对其液体发酵条件进行了初步的研究。

1 材料和方法

1.1 试验材料

1.1.1 供试菌种 供试菌种为糙皮侧耳复壮109，由天津农学院农学与资源环境学院食用菌研发中心提供。

1.1.2 玉米秸秆粉制备 秸秆原料采自静海良种场试验地。在烘箱内105 ℃下杀青2 h后，将烘箱温度调至80 ℃烘48 h至恒重，待自然冷却，用粉碎机磨碎成粉备用。

1.1.3 培养基 母种（PDA）培养基：马铃薯200 g、葡萄糖20 g、琼脂20 g、KH2PO42g、MgSO41 g、蒸馏水1 000 mL，pH值自然。

液体摇瓶培养基：葡萄糖20 g·L-1、玉米浆2 g·L-1、MgSO41 g·L-1、KH2PO40.5 g·L-1、K2HPO40.5 g·L-1。

1.2 试验方法

1.2.1 斜面菌种活化 用无菌的接种针，将供试糙皮侧耳菌株从保存的斜面上挑出，转接到PDA培养基平板上活化，25 ℃下培养7 d后，再转接到新的平板上，同样条件下培养后，用无菌打孔器在已长满菌丝的平板上制出直径为8 mm、厚约为2 mm的菌块，备用。

1.2.2 液体摇瓶种子生长曲线的确定 在每个250 mL三角烧瓶中装入种子液100 mL，在121 ℃的条件下高压灭菌20 min，灭菌后在冷却至30 ℃以下，每瓶接入上述糙皮侧耳菌块3～4块，25 ℃的恒温培养箱中静置1 d后转置转速为150 r·min-1，温度为25 ℃的摇床中继续培养。每天定时取样测干重，4次重复。

1.2.3 液体摇瓶发酵液的培养时间的确定 接种时取第7天的种子液按每瓶8%的比例吸取，接种于发酵培养基中，每个250 mL三角烧瓶中装入100 mL液体培养基，培养条件为温度25 ℃，转速150 r·min-1，每天定时取样，4次重复，用酶标仪测定木聚糖酶活力。

1.2.4 不同发酵条件对产酶影响的试验设计

（1）不同秸秆添加量对糙皮侧耳液体发酵液酶活力的影响。秸秆添加量设定为0 g·L-1、2 g·L-1，4 g·L-1，6 g·L-1，8 g·L-1和 10 g·L-1。

（2）不同装液量对糙皮侧耳液体发酵液酶活力的影响。在250 mL的三角瓶中分别装入60 mL，80 mL，100 mL和120 mL发酵液。

（3）不同pH值对糙皮侧耳液体发酵液酶活力的影响。pH值分别设定为4，5，6，7，8，9。

（4）不同转速对糙皮侧耳液体发酵液酶活力的影响。转速设定为150 r·min-1、180 r·min-1、210 r·min-1。

1.2.5 木聚糖酶活力的测定方法

（1）粗酶液的制备。取10 mL培养好的液体发酵液于离心管中，4 ℃下，4 000 r·min-1离心20 min，上清液即为粗酶液。

（2）酶活力的测定。取0.1 mL上清液于25 mL具塞试管中，加入0.9 mL木聚糖溶液（pH值5.0的50 mmol·L-1柠檬酸-柠檬酸钠缓冲液配制），40 ℃水浴保温30 min，取出后立即加入3 mL DNS试剂，煮沸10 min。流水冷却至室温后加入蒸馏水定容至25 mL，混匀后用酶标仪测540 nm处吸光值的变化，以煮沸灭活10 min的粗酶液作对照。酶活力单位定义为：每分钟催化木聚糖水解生成1 μmol木聚糖所需的酶量为一个酶活力单位（U）。

（3）酶活力的计算公式

酶活力：[W(mg·mL-1)×Df×1 000]／[M×30 min]

Df：表示稀释度V1（定容后的总体积25 mL）/V2（粗酶液的体积0.1 mL）

W（mg·mL-1）：酶解反应产生的木糖量，由标准曲线Y=0.0142+5.6682X得到

1 000：将mmol转换成μmol所乘的系数M：表示木糖的分子量，为150.13 mg·mmol-1

1.2.6 菌丝干重

（1）取10 mL液体发酵液于离心管中，4 ℃条件下，4 000 r·min-1离心20 min，去掉上清液并用蒸馏水洗涤，静置沉淀后再次离心，去掉上清液，放入80 ℃烘干箱进行烘干至恒重。（一般用于测定发酵液，种子液的生长曲线。

（2）取80目筛网，将整瓶菌液倒向其表面，过滤得菌丝球，用蒸馏水反复冲洗菌丝球上残留的培养基直至冲洗干净，将菌球转移到培养皿中，放入设有80 ℃的烘干箱烘干到质量不发生变化，用电子天平称重。

2 结果与分析

2.1 糙皮侧耳摇瓶种子液的生长曲线

根据糙皮侧耳种子液的生长曲线选择最适的接种发酵液的时间，从图1可以看出，随着时间的增长，糙皮侧耳液体种子液的菌丝呈干重先上升后降低趋势，第七天菌丝干重达到峰值16.33 g·L-1后逐渐降低。

图1 糙皮侧耳种子液的生长曲线

2.2 糙皮侧耳摇瓶发酵液的生长曲线

根据液体摇瓶发酵液的生长曲线，了解菌丝的生长规律以及达到酶活力峰值的时间，进而确定液体摇瓶发酵培养的终点。由图2可知，0～4 d糙皮侧耳液体菌种酶活力值没有太大的变化，4～5 d时快速增加，液体菌种培养到第五天时此菌种的酶活力值达到峰值49.23 U·L-1，此后菌体的酶活力值减小，因此，确定糙皮侧耳复壮109液体摇瓶的发酵终点为第五天。

图2 液体摇瓶发酵液的酶活变化曲线

2.3 不同秸秆添加量对糙皮侧耳产木聚糖酶活力的影响

以农业废弃物玉米秸秆粉作为诱导剂，诱导糙皮侧耳产酶[8]，玉米秸秆添加量分别为0 g·L-1，2 g·L-1，4 g·L-1，6 g·L-1，8 g·L-1和 10 g·L-1，进行产酶试验，结果如图3所示。

图3 秸秆对糙皮侧耳产木聚糖酶活力的影响

由图3可知，随着玉米秸秆含量的增加，木聚糖酶活力先增大后减小，秸秆含量为0～4 g·L-1时，木聚糖酶活力随秸秆含量的增大而升高，在4 g·L-1时，酶活力达到峰值52.29 U·L-1，随后随着秸秆含量的增大酶活力逐渐减小，当秸秆含量为10 g·L-1时，酶活力最低，这可能是由于加入的秸秆含量过大，导致发酵液中溶氧减少，从而影响糙皮侧耳的生长代谢。图3结果表明，加入一定量的玉米秸秆可以促进糙皮侧耳产木聚糖酶，在玉米秸秆添加量为4 g·L-1时，木聚糖酶活力最高，所以酶活力以玉米秸秆添加量为4 g·L-1最佳。

2.4 不同装液量对糙皮侧耳产木聚糖酶活力的影响

分别向250 mL的三角烧瓶中装入60 mL，80 mL，100 mL和120 mL发酵液，然后每瓶以8%的接种量接种，秸秆4 g·L-1，在温度为25 ℃，150 r·min-1的摇床中培养5 d后，取样测酶活力。

装料量对糙皮侧耳产酶的影响主要表现在两方面，一是装料量过多，引起锥形瓶内通风不畅，供氧不足，微生物生长不好而影响产酶；二是装料量过少，引起锥形瓶内基质表面水分蒸发过快，影响微生物的生长和代谢，产酶量仍然不高[9]。由图4可看出当装液量为60～100 mL时，酶活力值逐渐的在增大，在60～80 mL时增幅最大，当装液量为100 mL时，产木聚糖酶活力最高，酶活力值达到峰值56.01 U·L-1，所以选择装料量100 mL为宜。

图4 装液量对糙皮侧耳产木聚糖酶活力的影响

2.5 不同pH值对糙皮侧耳产木聚糖酶活力的影响

pH值对调节菌丝细胞内酸碱平衡和分解发酵液的营养物质具有一定作用。配制发酵液pH值分别为4，5，6，7，8，9，以研究不同的初始 pH 值对木聚糖酶活力的影响，结果见图5。

由图5可知，随着pH值的增加木聚糖酶活力在不断增大，当pH值为8时，酶活力值达峰值67.32 U·L-1，pH值达到9后酶活力有所下降，因此确定最佳pH值为8。

图5 pH值对糙皮侧耳产木聚糖酶活力的影响

2.6 不同转速对糙皮侧耳产木聚糖酶活力的影响

溶氧量的大小主要取决于转速的快慢，资料表明转速越大，溶氧越大，但太大的转速会产生较大的剪切力，反而抑制菌丝生长[10]。在前面的基础上，设置转速分别为150 r·min-1、180 r·min-1，210 r·min-1，结果见图 6。

由图6可以看出，不同的转速会导致酶活力值大小产生显著差异，当转速在180 r·min-1时，酶活力值达到峰值76.11 U·L-1，当超过180 r·min-1时，酶活力值减小，甚至降到最低，因此选用180 r·min-1为最佳转速。

图6 转速糙皮侧耳产木聚糖酶活力的影响

3 结论与讨论

我国玉米秸秆资源十分丰富，年产量约为3亿t[11]。研究表明，大部分玉米秸秆主要以堆积、烧荒等形式直接倾入环境，造成极大的浪费以及环境污染[12]。通过本试验发现，糙皮侧耳对玉米秸秆具有较强的降解能力，产木聚糖酶的能力也较高，本试验利用糙皮侧耳降解玉米秸秆，为固体农业废弃物——玉米秸秆的合理利用提供了依据，进一步解决了玉米秸秆引起的环境污染问题。

通过糙皮侧耳种子液生长曲线可确定最佳的接种时间为第7天，发酵终点为第5天，试验结果表明，利用玉米秸秆为主要原料，糙皮侧耳液体发酵产木聚糖酶的最佳发酵条件为：玉米秸秆含量为4 g·L-1，装液量为100 mL，pH值为8，转速为180 r·min-1。本试验利用糙皮侧耳降解玉米秸秆产生木聚糖酶，这对降低木聚糖酶生产成本，进行工业化扩大生产提供较好的依据，同时在农村环境工程提升及农民增收方面也具有一定的意义。

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