油松叶水提液的GC-MS分析

田 凯，王晓英

（1.唐山市丰润区行政审批局，河北 唐山 064000；2.唐山师范学院，河北 唐山 063000）

化感作用是指一种植物（包括微生物）通过向环境释放化学物质而对另一种植物（包括微生物）所产生的直接或间接的有利或有害作用[1]。植物主要是通过茎叶挥发、雨雾淋溶、根系分泌以及植物残株的腐解等途径向环境中释放化感物质，影响周围植物的生长和发育。

油松为常绿乔木，四季常青，抗寒性强，是我国北方城乡绿地建设中广泛应用的常绿树种。由于植物的化感作用，在园林绿化中，特别是我国北方寒冷地区，油松林下几乎为裸地，景观单一，生态功能较差[2]。前期研究结果表明油松鲜叶、落叶水提液、落叶腐解液对高羊茅均有化感作用[3]，但对油松鲜叶水提液、落叶水提液、落叶腐解液中化感物质的鉴定尚未见报道。本试验采用气相色谱－质谱（GC-MS）联用技术分析油松鲜叶、落叶水提液、落叶腐解液化学组分，探讨可能起作用的化感物质种类和含量，以期为进一步研究油松的化感作用及其应用奠定基础。

1 材料和方法

1.1 试验材料

油松鲜叶和落叶采集：2016年4月采取16 a生油松的2 a生叶及树冠下的凋落叶。

将油松鲜叶和落叶分别置于烘干箱内105 ℃下杀青30 min，70 ℃烘干至恒重，剪成段后放在粉碎机中粉碎备用。

土：收集园土，挑去其中的杂草、石块等自然风干，过0.25 mm筛备用。

1.2 试验方法

1.2.1 油松鲜叶和落叶水提液的制备 取烘干后的油松鲜叶和落叶粉末各120 g，分别加1 200 mL蒸馏水搅拌均匀，静置48 h，用八层纱布过滤2次后在4 000 r·min-1离心机中离心10 min，取上清液用普通滤纸抽滤2次，再用0.45 μm微孔滤膜抽滤4次，得到质量浓度为0.100 g·mL-1的母液，在4 ℃条件下保存备用。

1.2.2 油松落叶腐解液的制备 取烘干后的油松落叶粉末120 g，与600 g土壤混匀，加少许水，塑料薄膜封口（扎眼通气），置于人工气候箱内25 ℃恒温避光保存40 d，取出各腐解物烘干至恒重，加入蒸馏水1 200 mL搅拌均匀，静置48 h。用八层纱布过滤2次后在4 000 r·min-1离心机中离心10 min，取上清液用普通滤纸抽滤2次，再用0.45 μm微孔滤膜抽滤4次，得到质量浓度为0.100 g·mL-1的母液，在4 ℃条件下保存备用。

1.2.3 油松鲜叶水提液、落叶水提液、落叶腐解液成分分析 分别取5 mL水提液、腐解液母液加入2 mL乙酸乙酯萃取，吸取1µL萃取液进样，用Shimadzu GCMS-QP2010气相色谱-质谱联用仪进行GC-MS分析。

GC（TraceTM2000，CE Instrument Company）条件：色谱柱：rxi-5ms；石英毛细管柱（30 m×0.25 mm×0.25 μm）；升温程序：初始温度50 ℃，以15 ℃·min-1的速度升至180 ℃，保持15 min，再以10 ℃·min-1升到220 ℃，保持15 min；载气：He（99.99%），柱流速度为0.8 mL·min-1；进样口温度250 ℃。

MS（Voyager，Finnigan Thermo-QuestCompany）条件：电离方式：EI；电子能量70 eV；离子源温度200 ℃；传输线温度250 ℃；扫描质量范围39～450 amu。采用Xcalibur1.2版本软件、NIST08.LIB和NIST08S.LIB谱图库兼顾色谱保留时间定性。

2 结果与分析

2.1 油松鲜叶水提液成分分析

油松鲜叶水提液样品经乙酸乙酯萃取后进行GC-MS分析（图1），经 GC-MS联用仪标准质谱数据库 NIST08.LIB 和NIST08S.LIB的计算机检索，鉴定出其主要含有29种化合物，并采用面积归一化法确定了它们的相对百分含量（表1）。油松鲜叶水提液的主要成分是4-萜品醇（7.74%）、杜鹃醇（7.32%）、2,3-二氢苯并呋喃（6.72%），覆盆子酮（6.57%），4-((1E)-3-羟基-1-丙烯基)-2-甲氧基苯酚（6.28%），4-羟基-3-甲基苯乙酮（4.84%），2,2,4,6,6-五甲基庚烷（4.27%）等，其中萜类（13.76%），酚类（11.92%），酮类（11.41%），有机酸及其衍生物（11.09%），杂环（9.53%），烷烃（5.88%），芳香烃及其衍生物（4.23%），胺（2.52%），酯（2.18%），环烃及其衍生物（1.62%），酰胺（1.44%）。

图1 油松鲜叶水提液总离子流色谱图

表1 油松鲜叶水提液成分分析

2.2 油松落叶水提液成分分析

油松落叶水提液样品经乙酸乙酯萃取后进行GC-MS分析（图2），经 GC-MS联用仪标准质谱数据库. NIST08.LIB 和NIST08S.LIB的计算机检索，鉴定出其主要含有30个化合物，并采用面积归一化法确定了它们的相对百分含量（表2）。油松落叶水提液的主要成分为苯甲酸（18.67%），苄醇（12.61%），苯丙醇（7.02%），邻苯二酚（3.41%），其中有机酸（20.62%），芳香烃及其衍生物（15.95%），醇类（11.94%），杂环化合物（7.95%），酮类（7.69%），酚类（5.04%），烷烃（2.83%），酯类（1.04%）。

表2 油松落叶水提液成分分析

图2 油松落叶水浸体液总离子流色谱图

2.3 油松落叶腐解液的成分分析

油松落叶腐解物水提液样品经乙酸乙酯萃取后进行GC-MS分析（图3），经 GC-MS联用仪标准质谱数据库 NIST08.LIB 和NIST08S.LIB的计算机检索，鉴定出其主要含有31个化合物，并采用面积归一化法确定了它们的相对百分含量（表3）。油松落叶腐解物水提液的主要成分有异龙脑（9.67%），环己酮（9.42%），苯丙醇（4.84%），双环[2.2.1]庚烷-2-酮（4.44%），桉油烯醇（4.39%），2-氧杂二环[2.2.2]辛-6-醇（4.17%），氧化石竹烯（2.58%），其中醇类（30.1%），酮（18.45%），杂环化合物（6.96%），芳香烃衍生物（4.84%），醛（2.18%），萜类（1.71%）。

表3 油松落叶腐解物水提液成分分析

续表3

图3 油松落叶腐解液总离子流色谱图

3 结论与讨论

GC-MS法是检测物质化学成分的主要方法。近年来，在化感物质的鉴定方面大量运用该方法。程智慧等[4]采用GC-MS方法分析了百合根系分泌物中的主要物质，杨先国等[5]对丹参根系分泌物的组成分分进行了分析。本试验采用乙酸乙酯萃取、GC-MS法测定，从油松鲜叶水提液、落叶水提液以及落叶腐解物水提液中共鉴定出75种化学物质。油松叶从鲜叶、落叶、落叶腐解物的变化过程中体内化合物种类及含量都发生了变化。

油松鲜叶水提液和落叶水提液共有苯乙醇和覆盆子酮2种物质，说明油松新鲜叶和落叶的物质成分差异大。酚类和萜类是常见的化感物质，油松鲜叶水提液中萜类含量占13.76%、酚类含量占11.92%，其中邻苯二酚[6]、2,4-二叔丁基苯酚[7]等均已被证实为化感物质；油松鲜叶水提液中4-萜品醇、芳樟醇、α-松油醇、α-毕橙茄醇等萜类物质也是潜在的化感物质，具有较强的化感活性，往往在较低浓度时就表现出极强的抑制作用[8]。油松落叶水提液酚类、萜类物质含量较鲜叶有较大幅度降低，油松叶在枯落前将部分化感物质转移到植株其它生活部位，导致落叶化感物质含量及种类减少；这就从化感物质种类及含量角度解释了油松鲜叶水提液的化感作用大于落叶水提液[3]。

油松落叶水提液和落叶腐解物水提液共有化学物质7种，分别为苯乙醇、6,6-二甲基二环[3.1.1]庚-2-烯-2-甲醇、3-（4-羟甲基）-2-甲基环己酮、双环[2.2.1]庚烷-2-酮、环己醇、覆盆子酮、苯丙醇，各自独有的物质种类分别有23种和24种，说明落叶腐解后物质成分发生了较大变化。油松落叶水提液的主要成分有酚类（5.04%），有机酸（20.62%），醇类（11.94%），芳香烃及其衍生物（15.95%），杂环化合物（7.95%），酮类（7.69%），酯类（1.04%）。油松落叶腐解后，酚类物质未见，醇类、酮类含量增加，达30.10%和18.45%，出现萜类物质，但含量较低，从化感物质的种类和含量方面解释了油松落叶腐解后化感作用较落叶水提液减弱[3]。

化感物质成分的鉴定是化感作用研究的重要内容，也是解释化感作用现象的有力依据。本试验仅从油松叶不同生命形态角度分析化感物质，从物质大类上分析化感作用强弱，未能确定化感物质的具体种类与含量，应采用柱层析法和GC-MS相结合的方法[9]，应用柱层析法筛选出最佳流分，并对其进行GC-MS鉴定，进一步研究化感作用的物质种类。

[1]张琴，李艳宾，岳静，等.不同腐解方式下棉杆腐解液对棉花种子萌发的化感效应[J].种子，2014，4（30）：17-20.

[2]郑义，路雪梅，崔欣，等.油松浸提液对植物种子发芽及幼苗生长的影响[J].北京农业，2015，11月中旬刊：82.

[3]王晓英.油松叶水提液对高羊茅的化感效应研究[J].草原与草坪，2016，32（6）：14-20.

[4]程智慧，徐鹏.百合根系分泌物的GC-MS鉴定[J].西北农林科技大学学报（自然科学版），2012，40（9）：202-208.

[5]杨先国，刘塔斯，陈斌，等.丹参根际土壤浸提物的GC-MS分析[J].中国农学通报，2013，29（10）：173-177.

[6]吴珊，李孝红，杨龙.邻苯二酚和邻苯三酚对藻类化感作用的试验[J].水资源保护，2011，27（3）：69-71，74.

[7]张新惠，张恩和，柴强，等.2，4-二叔丁基苯酚对啤酒花幼苗光和特性的影响[J].甘肃农业大学学报，2006，41（50）：50-54.

[8] 张秋菊，朱诗禹，张连学.细辛根系浸提液和腐解液对小麦和黄瓜的化感效应[J].湖南农业大学学报，2014，40（3）：272.

[9]陈磊，云兴福.西芹鲜根及根际区物化感物质成分鉴定[J].华北农学报，2012，27（2）：157-164.