PI3K/Akt/Nrf2信号通路在电针刺减轻兔内毒素休克诱发急性肺损伤中的作用

韩 悦，史 佳，吴丽丽，张 圆，宫丽荣，余剑波

内毒素休克诱发急性肺损伤是临床危重症患者死亡的主要原因，死亡率可高达35.1%～46.1%，其发病机制的复杂化决定了目前临床治疗措施的局限性[1-2]。电针刺激治疗以传统针灸为基础，通过改变电刺激强度、频率、波形脉冲间隔等参数而进行行针治疗[3]。前期研究已证实，电针刺激足三里和肺腧穴可通过上调血红素氧合酶-1的表达而减轻内毒素休克诱发急性肺损伤，其机制涉及的信号通路尚不明确[4]。磷脂酰肌醇-3激酶（PI3K）/蛋白激酶B（Akt）具有促进细胞增殖，抑制细胞凋亡，参与细胞骨架重组等重要功能[5]。研究表明，PI3K/Akt通过调整激动蛋白微丝的排列及解聚，导致NF-E2相关因子2（Nrf2）/Kelch样环氧氯丙烷相关蛋白-1（keap1）复合体解体，参与Nrf2的活化，易位至细胞核识别并结合抗氧化反应序列元件（ARE），从而激活下游抗氧化蛋白如HO-1等表达，维持机体氧化还原稳态[6]。本研究拟评价PI3K/ Akt/Nrf2信号通路在电针刺减轻兔内毒素休克诱发急性肺损伤中的作用。

1 材料与方法

1.1 实验动物及分组 按照完全随机设计，有多组样本均数比较的样本含量公式估算出每组大概需要10只实验动物，本实验按需分成8组，选择健康清洁级雄性新西兰大白兔80只，2月龄，体质量1.5～2.0 kg，由天津市中国医学科学院生物工程研究所提供（许可证号：SCXK（京）2011-0008）。于室温18～22 ℃安静环境中常规饲养，昼夜交替，适应环境1周后进行实验。采取随机数字表法分为8组（n=10）：对照组（C组）、内毒素休克诱发急性肺损伤模型组（L组）、PI3K/Akt抑制剂-渥曼青霉素+内毒素休克诱发急性肺损伤组（WL组）、渥曼青霉素组（W组）、二甲基亚砜组（D组）、模型+电针刺组（EL）、模型+电针刺激非穴位组（SEL）、模型+电针刺+渥曼青霉素组（ELW）。

1.2 动物模型制备 实验前24 h禁食，自由饮水。参照文献[7]制备内毒素休克诱发急性肺损伤模型。耳缘静脉注射20%乌拉坦5 mL/kg麻醉后，仰卧位固定于自制兔台上，经耳缘静脉置管建立静脉输液通路。颈部备皮消毒，1%利多卡因局麻下剪开颈部正中皮肤，分离气管和右侧颈内动脉分别行气管插管和颈内动脉置管，维持自主呼吸，持续监测动脉压，兔静待30 min后，WL组、ELW组经耳缘静脉注射渥曼青霉素0.6 mg/kg（溶剂为0.08 mL/kg DMSO），D组给予等容量二甲基亚砜，其余组给予等容量生理盐水。30 min后，L、WL、EL、SEL组及ELW组静脉注射LPS 5 mg/kg（溶于2 mL 0.9%生理盐水)，C、W及D组给予等容量生理盐水。给予LPS后2 h内MAP未降至基础值75%或给予LPS后6 h内动物死亡的排除本研究。

参照中国针灸学会实验针灸研究会制定的《动物针灸穴位图谱》，选取兔双侧足三里穴（膝关节外下方腓骨小头下约5 mm处）和肺俞穴（第3胸椎棘突下旁开约1.5 cm处），将兔置于特制兔笼中，暴露针刺部位，常规备皮消毒，使用直径0.3 mm的一次性无菌针灸针，直刺进针5～7 mm。采用HANS2100A型疼痛治疗仪进行电针刺激，刺激时间9:30－10:30，30 min/次，1次/d，模型制备前1～4 d及模型制备过程中行电针处理。针刺参数为：疏密波，频率2/15 Hz，波宽0.2～0.6 ms，刺激电流1～2 mA，刺激强度以兔肢体出现轻微颤动为宜。SEL组以相同的参数电针刺激足三里和肺俞穴旁开0.5 cm非经非穴处。

1.3 标本采集与保存 静脉注射LPS或生理盐水后6 h，经颈内动脉取血置于促凝管中，4 ℃离心取上清液置于EP管中于-80 ℃冻存。放血处死兔，留取双肺组织，用4 ℃磷酸盐缓冲盐水洗去表面血渍，将右肺中叶组织浸入10%福尔马林溶液中固定，右肺下叶组织置于液氮罐中速冻后于-80℃低温冰箱保存。

取10%福尔马林溶液固定的肺组织，经梯度乙醇脱水置换，二甲苯透明后，常规石蜡包埋，切片（4 μm），HE染色，每张切片随机选取10个视野于光学显微镜下观察（×100），见图1。参照文献[8-9]进行肺损伤评分，取其平均值作为总体的肺组织损伤评分。评分标准如下：（1）肺泡充血和间质水肿：无异常为0分，轻度异常为1分，中度异常为2分，重度异常为3分；（2）肺内出血：无红细胞为0分，极少数为1分，较多数为2分，充满肺泡腔为3分；（3）肺泡腔或血管壁中性粒细胞浸润或聚集：无白细胞为0分，极少数为1分，较多数为2分，充满肺泡腔为3分；（4）肺泡壁增厚和透明膜形成：无透明膜形成为0分，＜20%肺泡出现透明膜为1分，20%～50%肺泡出现透明膜为2分，＞50%肺泡出现透明膜为3分。

1.4 检测指标及及检测方法 取-80 ℃保存的肺组织200 mg，制备10%组织匀浆，采用黄嘌呤氧化酶法测定SOD活性，采用硫代巴比妥酸法测定MDA含量，严格按照试剂盒操作步骤进行测定。SOD活性及MDA含量测定试剂盒均购自南京建成生物工程研究所。

采用双抗体夹心ELISA法测定血清TNF-α和IL-10浓度，取-80 ℃保存的血清，按兔TNF-α和IL-10 ELISA试剂盒（R&D公司，美国）操作步骤加样，用KHB ST-360酶标仪检测血清中TNF-α和IL-10浓度。

采 用 Western blotting法 测 定 p-Akt、HO-1、Nrf2核蛋白及总蛋白的表达，取右肺下叶组织，按照Thermo蛋白提取试剂盒说明分别提取核蛋白和总蛋白，离心取上清液后进行蛋白定量。取80 μg蛋白进行凝胶电泳、转膜、封闭后，加入兔p-Akt多克隆抗体（稀释度1∶300）、兔Nrf2多克隆抗体（稀释度1∶1000）和兔HO-1多克隆抗体（稀释度1∶1000），4 ℃孵育过夜，TBST漂洗后加入辣根过氧化物酶标记的山羊抗兔IgG抗体（稀释度1∶3000），室温下避光摇床孵育1 h后漂洗。于暗室中加入增强化学发光液进行曝光与显色，使用Quantity One凝胶成像分析系统扫描，以目的蛋白与内参β-actin条带积分光密度值的比值反映目的蛋白的表达水平，见图2。

统计学处理 采用SPSS18.0统计学软件进行分析，正态分布的计量资料以均数±标准差（±s）表示，组间比较采用单因素方差分析，以P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 肺损伤评分、血清TNF-α浓度及肺组织MDA含量和IL-10浓度及SOD活性比较 与C组比较，L组、WL组、EL组、SEL组和ELW组肺损伤评分、血清TNF-α浓度及组织MDA含量升高，而IL-10浓度及SOD活性降低（P＜0.05），W组、D组上述各指标差异无统计学意义（P＞0.05）；与L组比较，EL组肺损伤评分、血清TNF-α浓度及肺组织MDA含量降低，而IL-10浓度及SOD活性升高，WL组肺损伤评分、血清TNF-α浓度及肺组织MDA含量升高，而IL-10浓度及SOD活性降低（P＜0.05），而SEL组上述各指标差异无统计学意（P＞0.05）；与EL组比较，ELW组组肺损伤评分、血清TNF-α浓度及肺组织MDA含量升高，而IL-10浓度及SOD活性降低（P＜0.05）；与ELW组比较，WL组肺损伤评分、血清TNF-α浓度及肺组织MDA含量升高，而IL-10浓度及SOD活性降低（P＜0.05），见表1。

图1 各组肺组织病理学结果(HE染色×100)

2.2 p-Akt蛋白、HO-1蛋白、Nrf2核蛋白及总蛋白表达水平比较 与C组比较，L组、WL组、EL组、SEL组和ELW组肺组织p-Akt蛋白、HO-1蛋白、Nrf2核蛋白及总蛋白表达水平上调（P＜0.05），W组、D组上述各指标差异无统计学意义（P＞0.05）；与L组比较，EL组肺组织p-Akt蛋白、HO-1蛋白、Nrf2核蛋白及总蛋白表达水平上调，WL组肺组织p-Akt蛋白、HO-1蛋白、Nrf2核蛋白及总蛋白表达水平下调（P＜0.05），而SEL组上述各指标差异无统计学意（P＞0.05）；与EL组比较，ELW组肺组织p-Akt蛋白、HO-1蛋白、Nrf2核蛋白及总蛋白表达水平下调（P＜0.05）；与ELW组比较，WL组肺组织p-Akt蛋白、HO-1蛋白、Nrf2核蛋白及总蛋白表达水平下调（P＜0.05），见表2。

图1 各组肺组织病理学结果(HE染色×100)

图2 各组p-Akt、HO-1、Nrf2核蛋白及总蛋白表达结果

表1 八组兔肺损伤评分、肺组织SOD活性、MDA含量、血清TNF-α及IL-10浓度比较（n=10，（±s）

表1 八组兔肺损伤评分、肺组织SOD活性、MDA含量、血清TNF-α及IL-10浓度比较（n=10，（±s）

注：与C组比较，aP＜0.05；与L组比较，bP＜0.05；与EL组比较，cP＜0.05；与ELW组比较，dP＜0.05

组别 肺组织、损伤评分（分） SOD（U/mg） MDA（nmol/mg） TNF-α（ng/mL） IL-10（pg/mL）C组 0.7±0.4 102.3±6.9 1.69±0.23 1.35±0.11 7.69±0.64 L组 6.8±0.9a、c 67.6±3.8a、c 4.34±0.39a、c 3.14±0.23a、c 5.37±0.47a WL组 8.3±1.1a、b、d 42.3±2.6a、b、d 6.29±0.54a、b、d 4.62±0.32a、b、d 3.14±0.25a、b、d W组 0.9±0.5 106.9±7.3 1.61±0.22 1.37±0.13 7.63±0.71 D组 0.8±0.3 104.1±6.7 1.7±0.25 1.31±0.12 7.67±0.65 EL组 4.5±0.6a、b 87.5±5.6a、b 3.09±0.26a、b 2.03±0.18a、b 6.98±0.54a、b SEL组 6.5±0.7a、c 62.3±4.1a、c 4.31±0.35a、c 3.18±0.25a、c 5.34±0.43a、c ELW组 5.9±0.9a、c 57.4±3.5a、c 5.74±0.47a、c 3.96±0.28a、c 5.19±0.39a、c

表2 八组兔肺组织p-Akt蛋白、HO-1蛋白、Nrf2核蛋白及总蛋白表达水平比较（n=10，（±s）

表2 八组兔肺组织p-Akt蛋白、HO-1蛋白、Nrf2核蛋白及总蛋白表达水平比较（n=10，（±s）

注：与C组比较，aP＜0.05；与L组比较，bP＜0.05；与EL组比较，cP＜0.05；与ELW组比较，dP＜0.05

组别 p-Akt蛋白 HO-1蛋白 Nrf2核蛋白 Nrf2总蛋白C组 1.07±0.14 0.23±0.03 0.36±0.05 1.45±0.21 L组 1.58±0.29a、c 0.67±0.09a、c 0.84±0.11a、c 2.14±0.43a、c WL组 1.23±0.21a、b、d 0.48±0.07a、b、d 0.61±0.09a、b、d 1.82±0.32a、b、d W组 1.09±0.13 0.25±0.03 0.34±0.04 1.47±0.23 D组 1.08±0.15 0.26±0.04 0.35±0.06 1.46±0.22 EL组 1.93±0.32a、b 1.05±0.12a、b 1.37±0.18a、b 3.25±0.58a、b SEL组 1.52±0.28a、c 0.69±0.08a、c 0.89±0.12a、c 2.18±0.45a、c ELW组 1.46±0.24a、c 0.74±0.09a、c 0.94±0.13a、c 2.46±0.49a、c

3 讨论

静脉注射LPS是目前制备内毒素休克诱发急性肺损伤模型应用最为广泛的方法，LPS入血可引起机体中性粒细胞、单核巨噬细胞等发生复杂的免疫反应，释放大量的炎性介质及细胞因子造成微循环障碍，诱发急性肺脏损伤[10]。本实验以文献[2]以及文献[7]的前期研究为基础，采用经耳缘静脉缓慢注射LPS 5 mg/kg制备兔内毒素休克诱发急性肺损伤模型，并以LPS给予2 h内MAP下降至基础值的75%及以下为模型制备成功的标准。结果表明，给予LPS后肺组织形态学改变明显，肺W/D比值、肺损伤评分升高，血清TNF-α浓度及肺组织MDA含量升高，而IL-10浓度及SOD活性降低，提示内毒素休克诱发急性肺损伤模型制备成功。

电针穴位及针刺参数的选择是影响电针刺激效果的重要因素[11]。足三里穴属于足阳明胃经穴，肺腧穴属于足太阳膀胱经穴，前期研究已证实，电针刺激该穴位可产生肺保护作用，但具体作用机制尚不明确[12]。本研究参照文献[4]以及文献[10]设置电针参数，选取疏密波，频率为2/15 Hz。结果表明，电针刺激兔双侧足三里及肺俞穴后，肺组织W/D比值降低，肺损伤评分降低，血清TNF-α浓度及肺组织MDA含量降低，而IL-10浓度及SOD活性升高，表明电针刺减轻了内毒素休克诱发的急性肺损伤。

PI3K是存在于体内多种细胞的脂激酶，能磷酸化细胞膜上的磷脂酰肌醇家族成员，募集和激活下游靶物质而启动一系列信号级联反应。Akt又称蛋白激酶B（protein kinase B，PKB），是一种丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶，Akt/PKB是PI3K信号传导途径中重要的下游靶激酶[13]。研究表明[14-15]，渥曼青霉素是非ATP竞争型P13K抑制剂，0.6 mg/kg渥曼青霉素可成功阻断P13K/Akt信号通路，且无死亡及急性毒性反应，因此本实验选择静脉注射0.6 mg/kg渥曼青霉素作为阻断剂行预处理。在本实验中，与L组比较，EL组肺损伤评分、血清TNF-α浓度及肺组织MDA含量降低，而IL-10浓度及SOD活性升高，肺组织p-Akt蛋白、HO-1蛋白、Nrf2核蛋白及总蛋白表达水平上调，而WL组肺损伤评分、血清TNF-α浓度及肺组织MDA含量升高，而IL-10浓度及SOD活性降低，肺组织p-Akt蛋白、HO-1蛋白、Nrf2核蛋白及总蛋白表达水平均下调，提示电针刺激减轻内毒素休克诱发的急性肺损伤，注射渥曼青霉素后可影响P13K/Akt信号通路，从而加重急性肺损伤。与ELW组比较，EL组肺损伤评分、血清TNF-α浓度及肺组织MDA含量降低，而IL-10浓度及SOD活性升高，肺组织p-Akt蛋白、HO-1蛋白、Nrf2核蛋白及总蛋白表达水平上调，而WL组肺损伤评分、血清TNF-α浓度及肺组织MDA含量升高，而IL-10浓度及SOD活性降低，肺组织p-Akt蛋白、HO-1蛋白、Nrf2核蛋白及总蛋白表达水平均下调，提示电针刺激减轻内毒素休克诱发急性肺损伤被渥曼青霉素阻断，表明PI3K/Akt信号通路介导了电针刺减轻内毒素休克诱发急性肺损伤，其机制与激活Nrf2磷酸化，上调HO-1表达有关，HO-1不仅能够抑制内毒素休克急性肺损伤时TNF-α等炎性因子的释放，还能抑制中性粒细胞的作用，减少中性粒细胞的聚集，来减轻炎症反应对肺组织的损伤[14]。电针刺激双侧足三里和肺腧穴，机械刺激和电信号被细胞表面受体接受后转化为生物信号激活PI3K/Akt通路，促使Nrf2活化并与Keap1解离，转位入核，与伴侣蛋白小Maf形成异源二聚体，调控ARE依赖的靶基因HO-1的转录与表达，调动机体抗炎抗氧化应激能力，从而减轻内毒素诱发急性肺损伤[16]。

综上所述，PI3K/Akt/Nrf2信号通路介导电针刺激减轻兔内毒素休克诱发急性肺损伤的作用，其机制可能与上调HO-1表达从而抑制炎症反应相关，为内毒素休克诱发急性肺损伤的防治提供了新思路及理论依据。

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