金黄色葡萄球菌引起奶牛出血性乳房炎的诊治

王旭荣，李文杰，张淑霞，张 康，王海瑞，张景艳，李建喜*

(1.中国农业科学院兰州畜牧与兽药研究所，甘肃兰州 730050；2.西北农林科技大学动物医学院，陕西杨凌 712100)

乳房出血是由各种不良因素作用于乳房，引起输乳管、腺泡及其周围组织血管发生破裂而发生出血，血液进入乳汁，以产后最初几天最为常见。一般是由于乳房挫伤所致，如果一些产后母牛伴有血小板减少或其他血凝障碍性疾病，也易发生乳房出血[1]。乳房出血以后，为微生物的生长提供了丰富的营养物质，加剧了乳房炎发生的几率，而微生物产生的毒素又可以加重出血，造成恶性循环，给治疗带来困难。金黄色葡萄球菌可引起出血性乳房炎，溶血素是该菌的一种重要的致病因子，溶血素分为α、β、γ、δ 4种类型[2]，对人类有致病作用的主要是α溶血素，而造成奶牛乳房炎的牛源金黄色葡萄球菌主要表现为β溶血[2-3]，而且金黄色葡萄球菌的β溶血素能够损伤奶牛乳房上皮细胞， 增加α溶血素对机体的损害，促进该菌对奶牛乳腺上皮细胞的黏附和增殖。刘美清等[4]发现从人的痰液、血液、伤口分泌物等样本中分离的双溶血环的金黄色葡萄球菌有比例增加的趋势。为此，随着环境的不断改变和药物压力的选择，细菌的演化造成老病新发的态势，应引起临床兽医工作者的重视。

2016年12月甘肃省白银市某奶牛场有5头产后奶牛出现血乳，患病乳区红、肿、热、痛，即局部增温，患病乳区明显肿胀，挤乳躲避有痛感，有的乳房血肿非常严重，乳房皮肤呈红色甚至紫红色；出血较为严重，乳汁为暗红色絮状。病牛精神委顿，体温升高至41℃，食欲减少，反刍次数减少。使用青霉素、阿莫西林配合止血敏治疗无效。考虑到乳房出血一般是由碰撞、挫伤引起，在我们采样的同时，建议牛场先检查挤奶设备和排查饲养环境，但未发现造成乳房损伤的环境性因素。为查明造成该奶牛场出血性乳房炎的病因、病原菌及药物敏感性，为该场的本次发病提供有效的防治措施和建议，进行相关实验室检测,具体报道如下。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 样品采集 按照农业行业标准《奶牛乳房炎乳汁中金黄色葡萄球菌、凝固酶阴性葡萄球菌、无乳链球菌分离鉴定方法》(NY/T2962-2016)的乳样采集方法。先用温水清洗5头患病奶牛的乳房，然后依次用2 mL/L新洁尔灭浸泡的纱布、750 mL/L酒精棉擦拭消毒乳头。每个乳头弃去初始2把～3把奶，然后按无菌操作规程分别采集患病乳室的乳样约5 mL，采集的乳样保存于乳样采集管中，做好记录。在采样箱中加入生物冰袋或冰块，使乳样温度保持在2℃～8℃，立即带回实验室检验。采集的典型血乳如图1所示。

图1 患病奶牛的典型血乳Fig.1 The blood milk of the sick dairy cow

1.1.2 主要试剂和培养基 营养肉汤和血琼脂平板，广东环凯微生物科技有限公司产品；兔血浆，青岛高科技工业园海博生物技术有限公司产品；Premix ExTaqDNA聚合酶、DNA Marker、细菌DNA提取试剂盒、16 S rDNA BacteriaL Identification PCR Kit均，宝生物工程(大连)有限公司产品;青霉素G、阿莫西林、头孢西丁、苯唑西林、头孢吡肟、四环素、红霉素、庆大霉素、利福平、万古霉素、夫西地酸、利奈唑胺、克林霉素、奎奴普丁、呋喃妥因、磺胺甲恶唑、泰利霉素、美罗培南、环丙沙星、氯霉素等药敏纸片，Oxoid公司产品。

1.2 方法

1.2.1 细菌的分离与纯化 按照农业行业标准《奶牛乳房炎乳汁中金黄色葡萄球菌、凝固酶阴性葡萄球菌、无乳链球菌分离鉴定方法》(NY/T2962-2016)中的乳样接种方法，将待检乳样摇匀，无菌操作，用接种环取2环～3环待检乳样，间断划线接种于血琼脂平板上，置37 ℃恒温培养箱中培养18 h～24 h，观察细菌生长情况。为了进一步检验是否有厌氧致病菌的存在，同时每份乳样分别接种于血琼脂平板，培养于厌氧培养箱内，培养18 h～24 h，观察细菌生长情况。然后挑取细菌单菌落进行涂片、革兰染色、镜检、纯化，并将纯化后的细菌保存做好标记，然后进行下一步鉴定。

1.2.2 生化鉴定 对待检细菌进行接触酶试验和血浆凝固酶试验。

1.2.2.1 接触酶试验 按照农业行业标准《奶牛乳房炎乳汁中金黄色葡萄球菌、凝固酶阴性葡萄球菌、无乳链球菌分离鉴定方法》(NY/T2962-2016)的接触酶试验操作方法，取30 mL/L H2O2溶液1滴～2滴置于干净载玻片上，然后加一接种环被检菌落，与H2O2滴液混合，立即产生气泡者为阳性，不产生气泡者为阴性。

1.2.2.2 血浆凝固酶试验 选用商品化的兔血浆试剂，按说明书操作。在每支含有兔血浆的西林瓶中加入0.5 mL灭菌生理盐水轻微摇晃至完全溶解，然后加入0.3 mL金黄色葡萄球菌肉汤培养物充分混合后，置于37℃培养箱，每30 min观察1次，观察6 h，如呈现凝即倾斜或倒置时，呈现凝块或者凝固体积大于原体积的一半，被判定为阳性结果。本实验室保存的金黄色葡萄球菌作为阳性对照菌株，无菌LB肉汤为阴性对照。

1.2.3 16 S rDNA序列分析 用接种环挑取细菌单菌落置于含有1 mL生理盐水的1.5 mL 离心管中，涡旋3 min～5 min，充分混匀。12 000 r/min离心，去掉上清，严格按照细菌DNA提取试剂盒操作说明书提取被检细菌的DNA，并以此为模板，选择16 S rDNA Bacterial Identification PCR Kit 中的 forward primer和reverse primer扩增16 S rDNA 片段，而后进行核酸凝胶电泳。扩增的目的片段由北京六合华大基因科技股份有限公司测序,所得序列在NCBI( http：// ncbi．nLm．nih．gov /) 的在线 Blast软件对获取的序列进行搜索比对，并确定细菌种属。

1.2.4 动物致病性试验 取18只清洁级昆明小鼠，随机分成6组，1组对照组和5组试验组。5株金黄色葡萄球菌分离株分别接种到营养肉汤中，37℃培养18 h，与比浊管相比，细菌浓度约为1.0×109个/mL。取肉汤培养物0.1 mL，分别腹腔注射试验组小鼠，对照组注射等量生理盐水。随时观察小鼠发病情况。

1.2.5 药物敏感试验 将待检测的分离菌株接种到到LB肉汤，置于37℃恒温箱中培养12 h～18 h制成菌悬液。使用比浊仪对菌悬液标定到0.5麦氏比浊度，约1.0×108CFU/mL，将标定好的菌悬液，用灭菌棉拭子将待检细菌混悬液涂布于新鲜的MH培养基,涂布均匀，立即贴上药敏纸片，用灭菌镊子轻压纸片使其与平皿紧密接触不易掉落，之后放入37℃恒温培养箱中培养24 h后，用游标卡尺测量抑菌圈直径(mm)。结合临床用药实际情况选择药敏纸片，药物敏感性判断严格参考《CLSI的抗菌药物敏感性试验执行标准2013》，药敏纸片的规格及判断标准见表1。

表1 抗菌药物敏感性试验执行标准

注：“-”表示无相关数值。

Note：“-”means no data.

2 结果

2.1 细菌分离结果

从采集的5份奶样中均分离到同一类需氧兼性厌氧菌，有氧条件下，血琼脂平板上菌落形态均为湿润、光滑、隆起的圆形菌落，初呈灰白色，放置过夜后呈现金黄色，菌落周围形成明显的β溶血环，厌氧条件下，菌落稍小。革兰染色后镜检，发现分离的细菌均为G+，球形或椭圆形，成对排列，或呈葡萄状，初步确定为葡萄球菌属的细菌，疑似金黄色葡萄球菌。

2.2 生化鉴定

5株分离菌均为接触酶试验阳性；5株分离菌均为血浆凝固酶试验阳性，阳性对照和阴性对照均成立。

2.3 16 S rDNA 序列分析

分别以5株分离株的细菌 DNA 为模板，用16 S rDNA PCR扩增试剂盒，扩增片段的长度约1.5 kb(图2)，扩增片段由北京六合华大基因科技股份有限公司进行测序，所得序列通过在线 BLAST软件进行分析，结果显示，5株分离菌株与GenBank中的参考序列金黄色葡萄球菌FORC026(基因序列号CP013132.1)、金黄色葡萄球菌2148N(基因序列号CP016856.1)、金黄色葡萄球菌08-02119(基因序列号CP015645.1)的同源性为99%，故确定分离的5株细菌为金黄色葡萄球菌。

M．DNA标准DL 2 000 ；1～5. 5株分离株的16 S rDNA PCR基因片段；6.空白对照

M．DNA Marker DL 2 000；1-5.Gene fragments of 16 S rDNA PCR from 5 isolates；6.Blank control

图2 5株分离菌的16 S rDNA PCR扩增结果

Fig.2 PCR results of 16 S rDNA from 5 isolates

2.4 致病性试验

腹腔注射6 h后，小鼠出现萎靡不振、蜷缩，10 h～12 h后出现嗜卧不动、全身发抖等症状，24 h～48 h后试验组小白鼠均死亡。解剖小鼠，24 h内死亡的小鼠眼观未见明显的实质脏器病变，24 h～48 h死亡的小鼠肝脏、脾脏、肾脏有出血点，从小鼠的肝、脾等实质脏器中分离金黄色葡萄球菌。对照组小鼠正常。

2.5 药敏试验

药敏试验结果表明，在检测的20种药物中，此次分离的5株金黄色葡萄球菌对青霉素、阿莫西林和克林霉素耐药率均为100%，对庆大霉素耐药率为40%，对其他16种抗菌药物敏感(表2)。

表2 5株金黄色葡萄球菌对20种抗菌药物的敏感性试验结果

3 讨论

金黄色葡萄球菌是造成乳房炎的重要致病菌之一，随着奶牛产业的不断发展，金黄色葡萄球菌性乳房炎的发病率下降，但随着饲养环境的改变和药物压力的影响，细菌演化也在持续不断的进化，出现了老病新发的态势。林杰等已发现金黄色葡萄球菌可引起顽固性乳房炎[5]，而且也出现一些突变株，突变株的生物学特性和致病性发生了一定的变化[6-8]，这些新情况的出现为疾病防控带来新的难点和挑战。2016年底甘肃省白银市某奶牛场产后奶牛出现血乳，检查挤奶设备和排查饲养环境均无异常，在采集的病样中均分离到β溶血金黄色葡萄球菌，而且动物致病性试验表明有较强的致病性，结合本场曾多次发生金黄葡萄球菌性乳房炎的生物背景，说明该场一直存在致病性金黄色葡萄球菌，造成此次发病的主要原因是β溶血性金黄色葡萄球菌的感染。而且产后奶牛体质弱，或许有血小板减少或其他血凝障碍性疾病的诱发，导致临床症状严重，建议该场对部分产后奶牛进行血液指标进行监测，排除患病隐患。虽然国内随着乳房炎防控技术的提高，金黄色葡萄球菌引起的乳房炎发病率下降，但是由于牛群感染该菌后，容易形成慢性感染且易复发[9]，而且新的研究结果表明携带不同毒力因子的金黄色葡萄球菌其接触传染性风险不同[10]，故有金黄色葡萄球菌感染的生物背景的牛场仍不能放松对该病原的监测。

此次病例发生后，该场使用青霉素、阿莫西林配合止血敏治疗无效。笔者通过药物敏感性试验，发现此次分离的金黄色葡萄球菌对青霉素、阿莫西林的耐药率为100%，对苯唑西林、头孢类药物等其他16种药物敏感。结合我国批准的《无公害农产品 兽药使用准则》(NY/T5030-2016)，建议使用苯唑西林，配合使用止血药物，并且减少挤乳次数，检查维护挤奶设备，病情得以控制。该病例的诊治为进一步有效预防和治疗金黄色葡萄球菌引起的出血性乳房炎提供参考，而且提示兽医临床工作者对“老病新发”的临床表现要重视，在日常工作中应多加注意，切实做好牛场中一些病原的持续监测工作。

参考文献:

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[3] 李光超，武小虎，马友记，等.奶牛乳腺炎金黄色葡萄球菌溶血素基因型和表现型分析[J].中国兽医学报，2016,36(10)：1714-1717.

[4] 刘美清，兰 英，蔡 曼，等.双溶血环金黄色葡萄球菌的菌落特征与药物敏感性分析[J].中华医院感染学杂志，2016，26(9)：1921-1923.

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[7] 何娟梅,朱 军,巢国祥,等.一株金黄色葡萄球菌小菌落突变株的分离鉴定[J].微生物学报，2016，49(10)：1397-1402.

[8] Zhu L L,Zou F C,Yan Y L,et al.The characteristics ofStaphylococcusaureussmall colony variant isolated from chronic mastitis at a dairy farm in Yunnan province,China[J].Sci World J,2016，9157605. doi: 10.1155/2016/9157605.

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