自体骨髓间充质干细胞对二甲基甲酰胺中毒肝衰竭患者肝功能恢复的促进作用

N，N-二甲基甲酰胺（N，N-dimethylfomamide DMF）是一种用途广泛的化工原料和优良溶剂，可用于有机合成、无机化工、合成纤维、人造革等多个行业。由于DMF为无色胺味液体，具有挥发性，作业场所DMF可经皮肤和呼吸道吸收进入体内，对肝脏、肾脏及肺等器官造成损害，尤其是对肝脏的毒性作用较大[1]，严重者可出现肝衰竭，甚至导致患者死亡[2-4]。目前DMF中毒者并无特效解毒药，以保肝及对症治疗为主，人工肝为主的内科综合治疗是这类患者最主要的治疗手段，但人工肝治疗仅能暂时和部分替代肝脏功能，难以起到促进肝再生，改善肝功能的作用。近年来，大量研究表明干细胞具有促进肝细胞再生和修复肝损伤的作用[5-6]，已有不少学者开展了骨髓间充质干细胞（bone marrow mesenchymal stem cells，BM-MSCs）治 疗 肝衰 竭（失代偿期）肝硬化临床探索性研究，多数研究显示BM-MSCs具有改善肝功能的作用。但主要集中在病毒和酒精所致的肝衰竭方面[7-8]，尚未见应用于化学中毒性肝损伤的报道。本研究对1例急性DMF中毒性急性肝衰竭后肝功能迟迟得不到改善的患者，在内科综合治疗的基础上联合BM-MSCs肝动脉输注治疗，取得较好的效果，现结合文献分析报道如下。

资料与方法

一、临床资料

患者，男，36岁，已婚，以“腹胀、乏力伴皮肤、巩膜黄染约14 d，意识障碍1 d”入院。15 d前患者因食欲减退、腹胀、乏力，皮肤、巩膜黄染，就诊于当地医院，化验：谷丙转氨酶（ALT）589 U/L，谷草转氨酶（AST）559 U/L，碱性磷酸酶（ALP）200 U/ L，总胆红素（TBil）411 μmol/L，直 接 胆 红素（Dbil）273.6 μmol/L，凝血酶原时间（PT）37 s，部分凝血活酶时间（APTT）70.1 s，纤维蛋白原（FIB）0.83 g/L。腹部彩超提示肝实质回声增粗增强。予以保肝、利胆、退黄、补充血浆和营养支持等治疗效果不佳，且出现嗜睡、意识障碍，遂转入我院进一步诊断治疗。入院前在某皮革厂从事配料工作，有约2个月的“DMF”接触史。既往无肝炎病史，无药物暴露史、大量饮酒史、食物中毒史和过敏史，查体：生命体征平稳，嗜睡，呼之可应，无法正确回答问题，查体欠配合。全身皮肤和巩膜重度黄染，双下肢、注射和穿刺部位可见瘀点、瘀斑，无肝掌和蜘蛛痣，心肺无异常，腹部饱满，无压痛、反跳痛，肝脾肋下未触及，腹部移动性浊音阳性，双下肢无明显水肿。实验室检查：血细胞分析：白细胞（WBC）7.47×109/ L，NE 45.4﹪；肝功能：ALT 150 U/L，AST 187 U/L，ALP 93 U/L，TBil 356.0 µmol/ L，Dbil 118.3 µmol/L，血清白蛋白（ALB） 42g/L；凝血功能：PT 34.7 s，APTT 66.4 s；甲胎蛋白（AFP） 2.5 ng/ml，各种肝炎病毒检测均阴性，巨细胞病毒、EB病毒DNA低于检测下限，自身免疫性抗体及抗肝抗原均阴性。诊断急性重度DMF中毒，急性中毒性肝损伤，急性肝衰竭，肝性脑病（A型2级）。

二、方法

（一）内科综合治疗

入院后立即予食醋灌肠酸化肠道、静脉注射门冬氨酸鸟氨酸（7.5 g、2/d）和复方支链氨基酸注射液（250 ml、1/d）治疗肝性脑病，异甘草酸镁（150 g、1/ d）、还原型谷胱甘肽（2.4 g、1/d）保护肝细胞，补充人血白蛋白、冻干凝血酶原复合物、冻干纤维蛋白原、冷沉淀等血制品改善凝血肝功，及人工肝辅助支持治疗。

患者入院后黄疸持续升高，ALT、AST下降，出现“胆酶分离”现象，凝血酶原活动度（PTA）下降至10﹪左右。在人工肝为主（每2 ～ 3 d 1次）的内科综合治疗3周后，患者病情进展得到控制，肝性脑病好转。但随后患者的肝功恢复十分缓慢，从第3周到第8周，1个多月的时间内肝功无明显好转，反映肝脏合成功能的指标（PTA、ALB、CHOL）迟迟得不到改善，继续大量补充白蛋白、血浆、凝血因子等血制品，PTA一直在40﹪以下波动，TBil仍在正常检测值上限的5倍左右，肝功能持续处于失代偿状态，8周时评估Child-Pugh分级仍为C级，终末期肝病模型评分21分。考虑到患者存在大块或亚大块肝细胞坏死，有功能的肝细胞和肝小叶不足，肝功能恢复较困难。经医院伦理委员会批准，与患者签署知情同意书后，入院后第8周为患者进行了自体BMMSCs经肝动脉肝内移植治疗。

（二）BM-MSCs移植治疗

BM-MSCs制备：在无菌条件下，局麻从髂骨抽取患者骨髓血15 ～ 20 ml, 在A/B级层流实验室按1 : 1比例加入到含有骨髓稀释液的无菌离心管中，震荡混匀。用无菌注射器吸取淋巴细胞分离液，将其铺设于待分离的骨髓液下方，4 ℃条件下250×g，离心30 min（注意将离心机的刹车装置关闭），用无菌注射器吸取分离液与骨髓液之间的淡黄色液层（单个核细胞层），将收集到的单个核细胞按1 : 1比例与骨髓稀释液混合，4 ℃条件下250×g，离心15 min，弃上清后用骨髓稀释液重新悬浮沉积到试管底部的骨髓细胞，接种于250 ml培养瓶，置于体积分数为5﹪CO2饱和湿度的37 ℃恒温孵育箱中培养，约10 d左右细胞生长融合，收集细胞制备成骨髓悬液，活细胞计数，细胞数量1×107个/ ml。流式细胞仪鉴定显示 CD29+、CD44+、CD90+、CD34-、CD45-，符合国际细胞治疗学会间充质及组织干细胞委员会提出的BM-MSCs鉴定标准[9]。

BM-MSCs输注：在数字减影血管造影（DSA）下股动脉穿刺插管，造影显示肝固有动脉，将50 ml（BM-MSCs浓度为5.0×106个/kg）制备成的BMMSCs缓慢注入肝动脉，20 ml生理盐水冲管。术毕穿刺点加压包扎返回病房，穿刺侧下肢制动6 h。

结 果

一、肝功恢复情况

采取BM-MSCs移植治疗后，肝功能恢复加速，BM-MSCs治疗10 d后复查TBil较移植前下降了50﹪，PTA逐渐恢复到40﹪以上，术后4周ALB开始缓慢升高（图1），8周肝功能评估Child-Pugh分级A级（6分），MELD评分7分。

图1 患者肝功及凝血功能变化曲线

二、影像学变化

与3周时上腹部CT扫描（图2a）比较，BMMSCs输注后4周上腹部CT提示腹水消失，肝脏体积较前略有增大，肝左右叶比例失调，肝脏再生结节进一步增大，增强扫描动脉期结节强化较均匀，考虑再生结节以动脉供血为主，且血流丰富（图2b）。

三、病理改变

干细胞移植后8周在彩超引导下对再生结节行穿刺活检，镜检（图3）：肝组织病变不均匀，部分肝组织呈炎症病理改变（G3，S2，F1），肝细胞肿胀，少量气球样变，少量点状/灶性坏死，局部桥接坏死，轻度小泡性脂肪变性；部分肝组织呈慢性肝纤维化病理改变，肝细胞大块状坏死，被纤维组织取代，其间有细胆管增生和胆管内小胆栓形成，以及再生的肝细胞岛。

四、安全性及远期随访

患者在BM-MSCs移植术中及术后均未出现明显与干细胞治疗相关的不良反应。患者出院后每3个月复查一次，临床症状完全消失，可从事轻体力工作，生化提示ALP、GGT轻度升高，其余肝功能指标均正常，Child-Pugh分级保持在A级。影像学检查增强MRI上可见肝脏体积仍较小，肝叶比例失调，可见圆形结节形成，T1WI上高信号，T2WI上低信号，较前增大，逐渐充满整个肝右叶，DWI上未见信号增高，结节间纤维间隔粗细不均，肝脏再生结节随访3年未发生恶变（图2c、d）。

讨 论

DMF是公认已知的肝毒性化学药物，广泛应用于人造革行业，在常温下可挥发，即使是在佩戴手套和口罩的情况下作业，也可经皮经呼吸道吸收[10]，因此在炎热的夏天，高温、高湿条件下暴露DMF后，中毒的发生率较高[11]。DMF的中毒性机制尚未完全阐明，目前认为与其在体内的代谢过程及代谢产物异氰酸甲酯（MIC）相关[12-13]，MIC具有亲电活性，通过与蛋白质、核酸等细胞大分子物质共价结合造成细胞损伤，同时可与谷胱甘肽（GSH）结合生成S-（N一甲基氨基甲酰）谷胱甘肽（SMG），使内源性SMG减少，导致体内自由基清除减弱，自由基的增多加重细胞的损伤。Twiner等[14]研究还发现DMF可影响细胞内的pH值，抑制肝细胞的增殖、分化，影响肝细胞的再生。

图2 肝衰竭患者BM-MSCs移植前后肝脏影像学改变

BM-MSCs是骨髓中存在的一种具有自我更新和多向分化潜能的干细胞，体外扩增后移植入体内可分化为肝细胞[15]，替代正常肝脏所需的合成和代谢功能，更重要的是可通过旁分泌途径改变组织微环境，促进内源性细胞增殖和血管增生[6]，调节免疫反应减轻肝脏的炎症反应[16]，调控肝星状细胞改善肝纤维化[17]。将BM-MSCs移植应用于DMF中毒性肝衰竭患者的救治，移植入体内的BM-MSCs不仅可以通过旁分泌机制稳定肝细胞再生、增值的内环境，还可分化为肝细胞、胆管上皮细胞等进一步改善肝功能。

本例DMF所致严重肝衰竭患者急性期病情得到控制后，肝功能迟迟得不到恢复，影像学提示肝脏明显缩小，虽然能够看到再生结节，但是大块及亚大块肝坏死致使肝脏有效体积仍严重不足，因此，肝细胞坏死得到控制后，肝功能不全的表现持续得不到改善情况下，应用干细胞治疗后，患者肝功能不全的临床表现和实验室指标快速恢复，Child-Pugh分级由C级转为A级，终末期肝病模型评分由21 分降到7分，TBIL、PTA、ALB等主要肝功生化的变化规律与Peng等[7]的研究相一致。上述改变是在停止人工肝和其他内科综合治疗措施不变的情况下出现的，虽然不排除随着发病时间的延长肝功能自然恢复的存在，但从干细胞治疗后的肝功能变化的时间节点上仍可以判定BM-MSCs移植在肝功能恢复中发挥了重要作用。

有文献报道干细胞移植可能存在潜在的致癌性，间充质干细胞在体外连续传代培养后，可出现染色体畸变，恶性转化[18]；还可通过自分泌（旁分泌）途径改变肿瘤细胞微环境，促进肿瘤细胞的生长，刺激肿瘤细胞迁移和侵袭[19]。本例DMF中毒性肝衰竭经BM-MSCs治疗后，未出现相关的不良反应，腹部CT提示肝内再生结节增大，为排除恶变可能，行肝穿刺活检，病理提示肝组织病变不均匀，呈多形性损伤。光镜下肝组织表现为慢性炎症，部分肝组织呈局灶性肝纤维化，符合化学药物中毒引起区域性亚大块肝坏死的特殊病理表现[20-21]，其间有成簇的再生肝细胞岛，考虑为特异性DMF中毒肝细胞岛[22]，未见异形或癌变细胞。出院后每3 ～ 4个月复查肝脏影像学检查，随访至今已达3年余，肝内结节无明显增大，尚未观察到干细胞移植后肝脏癌变迹象。

图3 肝衰竭患者BM-MSCs移植后肝穿刺活检病理特点

本文探索性地将BM-MSCs应用于化工毒物DMF中毒性所致肝衰竭肝功延迟恢复的患者的治疗，取得了明显的疗效，提示BM-MSCs对DMF中毒肝衰竭患者肝功恢复具有一定的促进作用。但本文仅对1例患者进行研究和观察，其确切疗效有待于进一步扩大样本量和动物实验研究证实。

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