多能干细胞诱导分化为肾脏类器官的分子机制及应用前景分析

张登禄 杜枭航 孔峰 赵升田2,

多能干细胞（pluripotent stem cell，PSC）主要包括胚胎干细胞（embryonic stem cell，ESC）、诱导多能干细胞（induced pluripotent stem cell，iPSC）等。随着人们对干细胞特性认识的提高，干细胞在再生医学研究及应用领域发挥着越来越大的作用。在世界范围内慢性肾病发病率高达10﹪，日益成为一个严重的公众健康问题[1]。临床中，慢性肾病诊断为肾小球肾炎、隐匿性肾炎、肾盂肾炎、过敏性紫癜肾炎、红斑狼疮肾炎、痛风肾、肾病综合征、膜性肾病、肾病综合征和糖尿病肾病等等。慢性肾病如未能及时有效救治，导致病情恶化进展，则随病程迁延，慢性肾病患者将发展成为慢性肾功能不全、肾衰竭，最终形成尿毒症，严重威胁患者生命。慢性肾病的病理过程是一个渐进的、不可逆的肾单位损失，而肾单位是维持肾脏功能的基本单位。因此，肾单位再生研究具有重要的研究意义及临床价值。近年来，PSC体外诱导分化产生功能性的肾单位方法越来越成熟[2-4]。其中肾脏类器官的出现是肾脏再生领域中一个突破性的进展。2015年来自澳大利亚和美国的科研团队分别于10月份和12月份在Nature杂志发表肾脏类器官的体外培育的方法与结果[3-4]。两种方法培育出的肾脏类器官均具备肾单位的基本结构肾小管、肾小球、集合管，具有重要的应用和研究价值。

一、肾脏发育生物学基础

在发育生物学上，哺乳动物肾脏来源于中间中胚层（intermediate mesoderm，IM）。细胞从原始体节中胚层（primitive streak mesoderm，PSM）分化形成IM。IM分化产生两种关键的肾脏祖细胞（nephric progenitor cell，NPC）群体，即输尿管芽（ureteric bud，UB）和后肾间质（metanephric mesenchy，MM），分别形成集合管和肾单位。像许多器官一样，肾脏的发育涉及不同细胞之间相互诱导、自我组装形成最终的肾脏结构。在哺乳动物肾脏发育中，三对排泄器官（前肾、中肾、后肾）由头至尾依次排列。其中只有后肾成为出生后动物的永久性器官。后肾发育起始于MM产生胶质细胞源性神经生长因子诱导UB（肾管的分支）产生[5]。UB成长为间充质，然后通过二叉分支形成肾脏集合管。这种上皮分支的延长需要周围间质分泌胶质细胞源性生长因子，同时间质需要来自UB的信号。与UB关系最为密切的间质是帽间质（capmesenchyme）。这一细胞群体需要来自顶端的信号进行增殖与自我更新，同时也可以分化成具有滤过功能的肾单位。经典的Wnt信号可以诱导帽间质经过间质上皮转化产生肾单位[6-7]，而 FGF（FGF9，FGF20）、BMP（Bmp7 信号通过JNK）、低水平的Wnt信号及来自周围间质的信号是帽间质维持和增殖所必需的。因此，器官的发育过程是生态空间内自我组装过程。

二、PSC诱导分化成肾脏类器官的方法与分子机制

基于上述肾脏胚胎发育的机理，许多实验室最近报道了体外诱导人PSC生成肾脏类器官的方法[2-4]。

（一）基本方法

肾脏类器官的形成分为3个主要阶段。干细胞首先分化成PSM，进一步分化成IM，IM再分化成MM和UB。第一阶段：干细胞分化成PSM。PSM是中胚层和内胚层的祖细胞群，可以由小鼠ESC经过激活素A（activin A）与BMP4诱导而成[8]，其中activin A决定了内胚层向前体节中胚层分化而中胚层向后PSM分化[9]。在小鼠和人的ESC分化过程中，经典的Wnt信号也可以作为PSM的诱导剂[10]。

第二阶段：PSM分化成IM。原肠胚形成后，中胚层进一步产生IM、傍轴中胚层（paraxial mesoderm，PM）和侧板中胚层（lateral plate mesoderm，LPM）。过去的研究认为转录因子OSR1是IM甚至MM形成的标志[11]，最近研究发现OSR1在躯体中胚层延伸至LPM[12]。PSM经BMP4/activin A，诱导后3 d会有OSR1的表达，而IM其他标志物，比如PAX2和LHX1并无表达[12-13]，这一结果提示第二阶段分化需要新的生长因子的参与，FGF信号也可能参与该过程，FGF8从PSM至后躯干中胚层阶段均有表达，而FGF9在IM和PM中有表达[14-15]。在体外MM的生存需要培养基中加入FGF2/BMP7或FGF9。在FGF2或FGF9因子的刺激下，OSR1、PAX2和LHX1共同表达，其中PAX2的表达率超过80﹪，这些都是IM的分化特征[16]。FGF9诱导IM产生是浓度依赖性的(最佳浓度为200 ng/ml）抑制LPM的分子标志FOXF1和OSR1的表达[16]。因此，FGF信号可以有效并特异性地诱导PSM分化成IM。

第三阶段：IM分化成MM和UB。在哺乳动物发育过程中，IM分化成肾脏、性腺和肾上腺，肾管是首先形成的结构，沿着肾管从头至尾依次排列着三对排泄器官（前肾、中肾、后肾），他们均发源于同一肾源性脊髓，只有后肾一直保留，并且成为动物永久性器官，后肾形成的关键是重要细胞组分之间相关诱导作用。MM通过表达GDNF促进UB生成，UB通过表达FGF9为MM的生存提供了必要条件，通过Wnt信号通路诱导肾单位的形成，每个肾单位延长或分段形成许多不同功能的细胞类型。研究证实维甲酸（retinoid acid，RA）具有促进UB生长的功能[17]，RA和BMP7能够诱导小鼠ESC向肾系分化[18]，而FGF9可以维持小鼠肾单位祖细胞的状态[19]。利用BMP4/activin A诱导人体胚胎干细胞（human embryonic stem cells，hESC）分化后，从第6天至第17天加入200 ng/ml FGF9、50 ng/ml BMP7和0.1 μmol/L RA。整个诱导过程利用RT-PCR检测，结果显示：hESC逐渐从PSM中胚层（MIXL1，LHX1）经IM（OSR1、PAX2、LHX1）分 化 成 MM（SIX2、WT1、GDNF、HOXD11）[16]。HOXD11的表达提示了后肾的出现，重要的是，肾管（输尿管）上皮基因（C-RET、HOXB7）也同时被诱导表达，在诱导程序的第14天，ECAD+PAX2+上皮结构就已经出现，RA以浓度依赖的作用方式对这些早期上皮结构的形成起了促进作用，这些上皮结构和周围间质被证明有增殖的作用。在肾脏发育过程中，阳性表达SIX2和WT1的初始间质区被ECAD+输尿管上皮所包围，WT1+细胞的百分比在输尿管上皮出现后继续增加，提示WT1在肾单位祖细胞和分化更好的肾结构中均有表达，在诱导分化的第22天，足细胞标志基因（SYNPO、NPHS1和WT1）、肾小管标志基因（AQP1和SLC3A1）和集合管标志基因（AQP2和SCNNB1）都有明显表达[16]。

另外利用CHIR99021起始诱导程序，加入RA/FGF9可产生大量的输尿管上皮，但其周围的PAX2+MM细胞变得稀疏，相反，单独延长FGF9诱导分化，同样可以逐步诱导PSM、IM至MM/UB的分化，此方法可以更快地诱导干细胞表达肾脏标志物，MM基因比如SIX2表达持续时间更长[16]。另外一个输尿管上皮标志分子GATA3与PAX2共表达于输尿管上皮，更重要的是，输尿管上皮周围的MM更致密，更接近发育的肾脏，在这种方法中，PAX2在间质和输尿管上皮均有表达，在WT1+和WT-的细胞中均有HOXD11蛋白分子的表达，这一结果提示MM的存在。

（二）肾脏发育中不同细胞群的自我组装过程

在肾脏发育中形成了许多不同类型的细胞群，这些细胞群通过彼此间的信号转导形成自我组装的组织。Takasato等[16]利用CHIR99021-FGF9诱导程序对hESC进行了诱导培养，在第12 ～ 18天撤掉生长因子，到第18天伸长的ECAD+输尿管上皮被几簇间质（表达MM分子标志，WT1、SIX2和PAX2）所包围，这种MM的形成看上去像肾单位（肾小囊），表达JAG1和CDH6蛋白，此外，连接输尿管上皮与肾小囊腔体在肾单位成熟过程中出现。

肾单位形成是一个复杂的分段、形态改变和分化的过程。重聚实验结果表明，小鼠胚肾分离成单细胞可以与不分化和分化12 d的hESC形成聚集，以聚集体形式培养4 d后，进行分割鉴定。hESC源的细胞诱导分化成肾脏发育的主要组分，包括PAX2+CALB+输尿管上皮、CDH6+JAG1+早期肾囊、SIX2+WT1+NPC间质，而hESC源的细胞经BMP4/activin A-FGF9/BMP7/RA诱导只能分化成MM和UB[16]，这种细胞聚集在未分化的hESC细胞之间并不发生。

分离胚胎肾脏体外培养可以长成类器官：在周围输尿管上皮的刺激下分支产生输尿管上皮并经历肾单位的形成、形态改变和分段。hESC以单层细胞形式进行分化，可以用于研究不良环境对自我组装和形态变化的影响，在IM形成之后，将细胞消化分散以不同的密度重新接种继续培养，按CHIR99021-FGF9程序进行至第18天，以高密度接种的形成均匀的单层，而那些低密度接种产生许多小的、半球形的类器官分散于平板上。在上述两种情况下，WT1+MM和ECAD+UB均有分布，而体积较小的半圆形克隆形成紧密组装、更高级的结构，这一结果说明3D环境能够增强自我组装。

如果肾脏形态发生所需的细胞群都存在，培养hESC向肾脏方向诱导，应该可以形成肾脏类器官，不要其他支持细胞的参与。hESC分化培养至第18天后进行消化分离，离心形成细胞团块，继续培养4 d，组织分析发现ECAD+小管存在输尿管上皮分子标志PAX2、AQP2，或近端小管的分子标志AQP1和SLC3A19。同时发现，WT1+PAX2+MM存在于ECAD+输尿管上皮周围，这提示JAG1+ECAD+肾小囊形成，hESC通过培养分化形成的结构与正常小鼠胚胎肾脏通过分离、重聚形成的结构并没有不同，通过3次独立实验证实83﹪（5/6）的细胞团块具有自我组装能力[16]。

在发育过程和损失修复过程中细胞均具有自我组装的能力。在自我组装过程中，不同的细胞类型彼此之间采用特定的模式形成复杂的结构，这一过程涉及特异性的细胞-细胞识别、配体-受体信号和细胞-基质相互作用。

hESC分化过程产生相互作用的NPC群，后者自我组装形成早期肾脏，这体现了PSC分化产生肾组织技术上的巨大进步，然而，正常的肾脏发育涉及NPC自我更新与分化成肾单位之间的平衡。hESC诱导分化过程中形成许多肾小囊，但同时随着时间推移NPC会显著减少，产生祖细胞早熟的现象，这一现象在Six2突变小鼠中可以见到，这一点是改进分化诱导方法需要特别关注的一点。方法改进的策略包括生长因子、细胞外基质和氧含量的改变，以便更充分的再现胚肾，此外，利用生物反应器为类器官的培养提供3D环境，可能有利于类器官的分化组装。

（三）肾脏类器官诱导过程中主要信号通路

目前文献报道比较成功肾脏类器官诱导的策略主要有两种：BMP/FGF途径（图1a）；CHIR99021-FGF途径（图1b）。BMP/FGF途径：首先PSC在BMP4/activin A的刺激下向PSM分化，然后在FGF9的刺激下分化成IM，IM在FGF9/BMP7/RA的刺激下分化成MM和UB，二者进一步分化成集合管、近端小管和足细胞在内的类器官。CHIR99021-FGF途径：PSC在Wnt激动剂CHIR99021刺激下分化成PSM，后者在FGF9刺激下分化成IM，进而分化成MM和UB，两者相互诱导分化成包含集合管、肾小管和肾小球的肾脏类器官。

图1 肾脏类器官诱导过程中主要信号通路

三、PSC诱导分化为肾脏类器官的分子机制及应用前景分析

目前利用PSC诱导分化得到的类器官通常是不成熟的，类似于胎儿阶段的器官，与真正的器官相比外形上小很多。在目前的培养体系中肾脏类器官通常长到直径2 ～ 3 mm，没有血管并且缺乏尿排出的途径，因此无论从体积还是复杂程度上距离达到临床移植的标准还很远。然而，将肾脏类器官可应用于疾病模型的制备、药物筛选和再生治疗，其中再生治疗包括生物组织工程和细胞治疗。多细胞性和不同细胞群体之间的特定相互作用使这些结构信息可以反映肾毒性，体外缺乏可靠的对药物毒性进行评估的模型，这是新药开发中的一个重要障碍。药物进入临床需要肾毒性检测，目前通常采用分离原代近曲小管上皮预测体内反应，这种方法并不太稳定[20]。目前，研究正在尝试利用人PSC诱导分化得到的肾近曲小管上皮进行肾脏毒性检测[21]，利肾脏类器官检测药物肾毒性可以提高检测的可靠性，因为近曲小管细胞周围存在间质成分，比单纯的近曲小管细胞更接近体内环境，利用成体胃肠道干细胞制备的胃类器官可用于幽门螺杆菌检测已得到实验论证[22]，利用患者来源的iPS细胞产生的类器官可用于建立疾病模型。当进行鉴定新的致病基因研究时，制备患者特异性的类器官有利于对新基因进行快速的功能鉴定，利用类器官开发高含量-低通量筛选模型进行特定治疗药物的筛选是可行的。一般情况下，干细胞产生的类器官由于缺乏血管通常大小是有限的。放大这样的组织或类器官用于移植在生物工程学上是一大挑战，特别是像肾脏这样的大器官。三维旋转培养已经用于改善脑类器官的结构，但开发能够支撑类器官向更成熟体积更大的方向发展的器官培养器非常有必要。

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