Xpert MTB/RIF和荧光定量PCR在痰液标本中快速检测结核分支杆菌的比较

杜 鹏，郑文斌，卢留珠，吴健虹，张 琦，吕纯芳，张 涛

(深圳市南山区慢性病防治院，广东 深圳518054)

结核病作为全球最严重的公共卫生威胁，世界卫生组织发布的2015年全球结核病报告显示结核菌的感染率首次逼近艾滋病，2014年共有960万新发结核病病例，150万人死于结核病，其中40万人同时感染了艾滋病毒。我国2014年新发结核病病例93万，仅次于印度与印度尼西亚而位居全球第三[1]。结核病防控的一个重要方面是快速、有效诊断。2010年12月，WHO推荐Xpert MTB/RIF(Xpert)作为结核病的快速诊断及对利福平的耐药性检测，它不仅具有高敏感性与特异性，并且能在2小时内完成检测。Xpert以半巢式实时定量PCR扩增技术为基础，根据rpoB的利福平耐药决定区(RRDR)设计引物与探针，所以能同步检测是否为利福平耐药菌株。荧光定量PCR作为另一种在全球结核病诊断中广泛应用的核酸扩增检测(NAAT)技术，国产荧光定量PCR检测方法与Xpert的比较评估不多，本研究旨在以MGIT960结核菌培养为金标准，比较Xpert和国产荧光定量PCR在结核病快速检测方面的应用，为基层实验室在结核病快速核酸检测方法的选择提供参考。

1 材料与方法

1.1标本收集收集2014年7-2015年8月在深圳市南山区慢性病防治院肺科门诊就诊患者的痰标本183份。年龄范围16-81岁，男121份，女62份；初诊170份，复诊13份。

1.2主要试剂和仪器Xpert MTB/RIF检测系统与试剂(美国 Cepheid)，抗酸染色试剂(珠海贝索)，显微镜(奥林巴斯)，BACTEC MGIT 960系统及试剂(美国 BD)，荧光定量PCR仪(Lightcycler 480Ⅱ，罗氏)，结核分枝杆菌核酸检测试剂盒(湖南圣湘)。

1.3方法

1.3.1标本留取 每个患者要求送早、晚、随机痰液标本三份，挑取痰液质量好的部分用于涂片镜检，余下的痰液混匀，一份用于Xpert检测，一份用于BACTEC MGIT 960的培养，一份用于结核杆菌荧光定量PCR的检测。

1.3.2Xpert检测方法 取1 ml痰标本加入有螺旋盖的50 ml离心管中，加入两倍痰标本体积的样本处理液(Sample Reagent)，涡旋振荡20 s左右，直至无肉眼可见块状痰。室温放置15 min，使痰液充分消化，用无菌吸管吸取2 ml处理后痰液，缓慢加入Cartridge 反应盒中；将反应盒放入Xpert仪器中，按操作规程进行操作，2h后仪器自动判读结果。按照仪器说明书，5个探针中至少有2个探针Ct值≤38 即为检测到结核杆菌，Ct值<16为高含量，Ct 值16-22 为中等含量，Ct 值22-28 为低含量，Ct 值>28 为极低含量。

1.3.3MGIT 960培养方法 取适量痰标本加入50 ml离心管，视痰性状加入1-2倍体积4% NaOH-NALC，涡漩振荡混匀2-3 min，室温放置15-20 min后加入0.1M无菌pH 6.8磷酸盐缓冲液至50 ml；3 000 rpm/min低温离心15 min，弃上清，加入1-2 ml 0.1 M无菌pH6.8磷酸盐缓冲液，混匀；将营养添加剂 GrowthSupplement倒入杂菌抑制剂 PANTA试剂瓶中，充分溶解混匀后吸取0.8 ml加入到 MGIT7 ml液体培养管中，然后再加入0.5 ml 标本；将培养管移入MGIT 960仪器中，按操作规程进行操作。

1.3.4荧光定量PCR检测 取适量痰标本加入50 ml离心管，视痰性状加入2-3倍体积4%的NaOH溶液，震荡混匀后静置30 min；取液化后的样本500 μl加入无菌离心管中，10 000 rpm离心3 min，弃上清，加入1 ml生理盐水重悬；再次12 000 rpm离心3 min，弃上清，加入50 μl核酸释放剂，100℃恒温加热10 min，然后12 000 rpm/min离心3 min，取上清作为待测样本。于PCR管中分别加入前处理的样本、阴性对照、阳性对照各5 μl，每管加入PCR-Mix(反应液38 μl+酶混合液2 μl+内标1 μl)40 μl，盖上管盖，2 000 rpm离心30 s，移入荧光定量PCR仪中；扩增程序如下：50℃ 2min；94℃ 2 min；94℃ 5 sec、57℃ 30 sec(45 cyclers)；40℃ 10 sec。

1.4统计分析采用SPSS13.0统计软件进行数据分析，Xpert和荧光定量PCR法检测结果比较用配对χ2检验，P<0.05为显著性差异，有统计学意义。

2 结果

2.1比较Xpert和荧光定量PCR的灵敏度和特异性

收集的183份痰标本进行了上述三种方法的检测，有10份痰标本MGIT960培养为污染，有效样本为173份。在173份样本中，有93份样本MGIT960培养阳性，阳性率为53.8%(93/173)；86份样本Xpert检测为阳性，灵敏度为84.95%(79/93)，特异性为91.25%(73/80)；82份样本荧光定量PCR检测为阳性，灵敏度为80.6%(75/93)，特异性为91.25%(73/80)。Xpert与荧光定量PCR两种方法比较，差异无统计学意义(P=0.747，P>0.05)(详见表1)。

表1 痰液中结核杆菌Xpert、荧光定量PCR以及MGIT960法检测结果的比较

2.2Xpert与荧光定量PCR检测阳性而MGIT960培养阴性的结果

在173份痰样本中，有7份样本是MGIT 960培养结果为阴性，但Xpert和荧光定量PCR 检测结果为阳性。这7份样本中有3份为复诊样本，4份为初诊样本。初诊样本Xpert检测结果等级为低含量的有3份，极低含量的有1份。

2.3Xpert与荧光定量PCR检测结果不一致的结果

在173份痰样本中，有8份样本Xpert与荧光定量PCR检测不一致，其中7份样本为Xpert阳性而荧光定量PCR阴性，1份样本为Xpert阴性而荧光定量PCR阳性，具体结果见表2。

表2 结核杆菌Xpert与荧光定量PCR检测结果不一致标本分析

注：※MGIT 960培养液抗酸染色镜检时发现杆菌不规则排列，疑似有非结核分枝杆菌的混合感染

3 讨论

结核病作为一种人间传播疾病，有效快速的诊断是结核病防控的关键[2]。现有的结核病诊断方法中，抗酸染色虽然简便，但灵敏性太差；液体培养的灵敏性虽然高，但耗时长，延误疾病的诊断与治疗。随着核酸检测技术的进步，荧光定量PCR得以广泛应用，它的主要优点在于缩短了检测周期，全自动操作程序既减少了手工操作，同时还降低了交叉污染的风险[3]。

本研究共有183份样本，有10份样本MGIT 960培养为污染，污染率为5.5%，基本符合临床TB实验室污染控制要求。余下的173份样本， Xpert检测无效的有8份，无效率为4.37%，低于Elisa Ardizzoni[4]所报道的6.3%的无效率，无效检测不仅提高了检测费用，还造成了样本的浪费。对于检测结果无效的样本，我们取原样再次检测，检测结果为有效。无效检测产生的原因可能有：(1)痰液液化不充分，有颗粒的存在；(2)消化液中有气泡；(3)消化后样本中残留PCR抑制物；(4)试剂质量问题。173份样本，MGIT 960培养阳性的有93份，其中Xpert检测阳性的有79份，荧光定量PCR检测阳性的有75份。以培养结果为金标准，Xpert检测灵敏度为84.9%(79/93)，特异性为91.25%(73/80)；荧光定量PCR检测灵敏度为80.6%(75/93)，特异性为91.25%(73/80)，两种方法的灵敏度与特异性都较好，Xpert的灵敏度比荧光定量PCR稍微高些，但差异无统计学意义(P=0.747，P>0.05)。

目前国内对Xpert检测方法和荧光定量PCR在结核病快速检测方面的比较研究很少，高漫[5]等人的研究发现Xpert的灵敏度为65.9%，特异性为100%；刘慧梅[6]等人的研究发现Xpert的灵敏度是75.8%，特异性是79.7%；国外有研究发现，Xpert的灵敏度为50%-95%，特异性为94%-98%，荧光定量PCR的灵敏度为46%-78%，特异性为98%-100%。两种检测方法的灵敏度差异太大主要在于检测样本种类与来源、以及荧光定量检测试剂的不同[2,7-9]。本研究中，Xpert的灵敏度高于荧光定量PCR的原因可能有：(1)样本都为痰液，没有肺外结核的样本；(2)痰涂片阴性样本占71.6%，阳性比例较高。但我们也发现Xpert并没有达到理论上的高灵敏度，可能的原因有：(1)本实验中Xper针对的是直接的样本，没有如国外对非痰液样本进行浓缩[10-13]；(2)Xpert系统没有去污染步骤，存在PCR抑制因子，在低菌量时影响较大[9]；(3)菌量太低，超出Xpert的检测下限[14]。

核酸扩增检测(NAAT)针对的是核酸上的靶序列，这决定了它的高特异性，我们发现了7份样本MGIT 960培养为阴性，而Xpert和荧光定量PCR为阳性，我们推测最大的可能是由于死菌的存在，它们无法在液体培养系统中生长。出现这种培阴现象一方面可能为复诊化疗药物的杀菌作用，这7份样本中有3份为复诊样本；另一方面可能是去污染过程中NaOH影响了结核杆菌的活性，有研究发现它可以杀死高达60%的结核分枝杆菌[15]，这在低菌量时影响较大。培阴中的4份初诊样本3份Xpert报阳等级为低含量，1份为极低含量，皆为低菌量报阳样本。为了比较Xpert和荧光定量PCR两者的检测差异，我们对检测结果不一致的样本进行分析，73份样本中有8例样本Xpert与荧光定量PCR检测不一致，包括7例Xpert阳性而荧光定量PCR阴性，1例Xpert阴性而荧光定量PCR阳性。7例Xpert检测阳性的标本，其等级基本都为极低含量，除SZ80外，培阳时间都高于13天；同时该7例样本采用涂片镜检进行等级分类，只有一个为1+，其余都为阴性，Xpert的报阳等级和涂片镜检结果都提示为低菌量样本。另外 1例Xpert阴性而荧光定量PCR阳性的标本培养报阳时间为20天，荧光定量Ct值为35.78，同样表明样本的含菌量很低。综上所述，我们推测，在检测低菌量样本时，Xpert的表现优于国产荧光PCR。在研究中，我们还发现了一例特殊样本SZ80，该样本经Xpert检测为阳性，MGIT 960培养后取培养液抗酸染色镜检，发现分散排列，怀疑是结核杆菌和非结核分枝杆菌的共同感染，我们将进一步进行确认。

Xpert系统和国产荧光定量PCR系统都在结核病检测诊断方面具有良好的灵敏度和特异性，考虑到荧光定量系统需要进行样本的前处理和核酸的提取，不仅增加了试验时间，还提高了污染的风险，生物安全等级要求也较高，同时荧光定量检测易受不同品牌检测试剂质量的影响；而Xpert检测需时短、自动化程度高、试剂封闭稳定，当然我们也不能忽视Xpert检测昂贵的费用。综上所述，我们应继续优化国产荧光定量PCR检测系统，从而为基层实验室在结核病核酸检测方法的选择提供参考。

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