ApoE基因多态性与脑电图慢波的关联性研究

罗伏钢 李静 陈梅芳 迟淑梅 宋明芬

老龄化是当今社会人口发展趋势，其中痴呆是影响人们晚年生活质量的常见疾病之一[1-2]。目前对痴呆尚缺乏有效的治疗措施，早期预测其发生的可能性以及出现的早晚，有利于尽早进行干预与预防[3]。目前普遍认为，痴呆患者在出现临床表现之前，其脑电图（electroencephalogram，EEG）已表现出异常，其中特征性改变为慢波出现，具体表现为快波α波和β波活动减少，慢波θ波和δ波频繁出现，即脑电图慢波化[3]。但是，个体发生痴呆的可能性以及何时发生是个未知数，频繁地测定脑电图来判断痴呆是否发生，不仅给人们带来不便以及造成经济压力，也加重了现有医疗资源的不足。目前研究表明，ApoE基因多态性影响体内载脂蛋白的功能。根据ApoE基因型对ApoE 112和158位点氨基酸的影响，将ApoE 基因型分为 3 种，即 ε2、ε3 和 ε4。ApoE ε2 由 ε2/ε2 和 ε2/ε3 组成，ApoE ε3 由 ε3/ε3 组成，ApoE ε4 由ε2/ε4、ε3/ε4 和 ε4/ε4 组成[2]。其中 ε4 等位基因可以显著地升高人体内TC浓度，使之易患动脉粥样硬化[4]。已有研究表明，ApoE ε4/ε4基因型在阿尔茨海默病（Alzheimer disease，AD）、血管性痴呆（vascular dementia，VD）中的比例明显高于对照组[5-7]。但是ApoE基因多态性与脑电图慢波之间的关联性尚缺乏研究。因此，本研究旨在探索ApoE基因多态性是否与痴呆发生前的脑电图慢波及其出现的年龄相关，从而为预测痴呆的发生，并尽早开始干预与预防提供参考。

1 对象和方法

1.1 对象 选择2016年1月至12月我院老年痴呆早期干预门诊的患者112例（研究组）和周边社区的健康人群112例（对照组）。两组间性别、年龄、婚姻、BMI、受教育年限、降压药使用人数比较均无统计学差异（均P＞0.05），研究组血清TG和TC浓度均高于对照组（均P＜0.05），详见表1。研究对象入组时，血压均控制在正常值或正常高值范围之内，因部分研究对象通过降压药进行血压控制，所以入组时的血压值，不能代表其真正的水平，故本研究没有对血压值进行比较。本研究通过本院伦理委员会的批准，研究对象本人或家属同意参加此研究，并签署知情同意书。

1.2 纳入与排除标准 纳入标准：意识清，年龄、性别不限，无脑梗死及相关用药史，详细收集病史、体格检查、神经系统检查、精神检查、颅脑CT检查均无异常者，进行简易智能量表（MMSE）评定。MMSE评分＞24分，尚未发生痴呆者，对其进行脑电图检查，将脑电图出现慢波且1周后复测仍存在明确的慢波者纳入研究组。同时，在周边社区收集性别、年龄、生活习惯等匹配的正常健康对照。排除标准：吸烟，饮酒，酒精或药物依赖，重要脏器严重疾病，心血管疾病，传染病，以及可能引起继发性脑电图改变的疾病如颅内占位性病变、脑外伤等。

表1 两组研究对象一般资料

1.3 资料收集 收集性别、年龄、慢波始发年龄（若此次研究前慢波已经确诊，则根据病历以首次明确慢波出现的时间）、婚姻状况、职业、学历、生活习惯（吸烟、饮酒、体育锻炼情况等）、疾病史（各类急慢性躯体、精神疾病）、是否服用降压药物、血清TG、TC浓度等资料。

1.4 脑电图检查 两组对象在体格检查、神经系统检查、精神检查、颅脑CT检查均无异常后，且MMSE评分＞24分的情况下，进行脑电图检查。采用美国EMS型脑电图仪，按照国际10-20系统，安置头皮电极，做16 导 导 联 采 样（FP1、FP2、F3、F4、C3、C4、P3、P4、O1、O2、F7、F8、T3、T4、T5、T6），接地电极置于 Fpz，双侧耳电极作为参考电极。患者取坐位或卧位，清醒闭目状态下，记录10min。每例对象以8s为1个采样单元，选无伪迹脑波采样，间断选取1个采样单元，与健康对照比较，如α、β波减少，且θ波和δ波增多、频率变低、波幅下降则判定为脑电图慢波。次周重复测定，结果一致者判断为脑电图慢波。

1.5 ApoE基因多态性测定

1.5.1 DNA提取 脑电图检查结束后，采集上述研究对象的K2EDTA抗凝血液约1ml，其中0.5ml用于ApoE基因型测定，另外0.5ml用于备查。采用天根生化科技（北京）有限公司生产的血液基因组提取试剂盒抽提血液DNA。操作步骤如下：取0.5ml K2EDTA抗凝血，加入含蔗糖、Tris-HCl、氯化镁的裂解液对细胞进行裂解，11500×g离心1min，弃上清液，往白色沉淀中加入20mg/ml蛋白酶 K 20μl以及 10%SDS 200μl，56℃10min 进行蛋白质降解，加200μl无水乙醇沉淀DNA，12000r/min离心后用70%乙醇进行清洗，最后将DNA溶解在TE缓冲液（Tris 10mmol/L、EDTA 2mmol/L）中，-20℃保存待用。离心机为美国Thermo公司生产，型号：fresco17。

1.5.2 ApoE基因多态性测定 PCR扩增仪为美国ABI公司生产，型号：Veriti。引物为生工生物工程（上海）股份有限公司生产。PCR反应分为A、B两个反应体系，体积均为25μl，包含以下共同组分：50ng基因组DNA，12.5μl 2×GC buffer I（Takara公司），0.8μmol/L 共同引物，序列为 5′-GTTCAGTGATTGTCGCTGGGCA-3′。A 反应体系为扩增半胱氨酸基因的扩增体系，除上述成分外，还包括0.8μmol/L识别158位点半胱氨酸的引物（5′-ATGCCGATGACCTGCAGAATT-3′）和 0.4μmol/L 识别112位点半胱氨酸的引物（5′-CGCGGACATGGAGGACGTTT-3′）。B反应体系为扩增精氨酸基因的扩增体系，除上述共同成分外，还包含0.8μmol/L识别158位点精氨酸的引物（5′-ATGCCGATGATGACCTGCAGAATC-3′）和0.4μmol/L识别112位点精氨酸的引物（5′-CGCGGACATGGAGGACGTTC-3′）。PCR 反应条件为：95℃预变性 4min，96℃变性 45s，66℃退火 45s，72℃延伸45s，循环35次，最后72℃延伸5min。结果判读：A反应液中如果112位点为半胱氨酸，可得到588bp的条带；158位点如果为半胱氨酸，可得到451bp的条带；B反应液中如果112位点为精氨酸，可得到588bp的条带；如果158位点为精氨酸，可得到451bp的条带。根据ε2的158和112位点均为半胱氨酸，ε4均为精氨酸，ε3分别为半胱氨酸和精氨酸的规律，可判断出每例被试对象的ApoE基因型。

1.6 统计学处理 采用SPSS 19.0统计软件。计量资料以表示，组间比较采用t检验；计数资料以及基因型、等位基因频率的比较采用χ2检验。研究组中不同基因型间的年龄差异比较采用方差分析。P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 两组ApoE基因型和等位基因分布比较 基因型的组间比较：研究组ε4型显著高于对照组（χ2=31.86，P=0.000）；研究组 ε2、ε3 型明显低于与对照组（χ2=5.25、13.03，P=0.02、0.000）。等位基因的组间比较：研究组 ε4频率明显高于对照组（χ2＝40.42，P=0.000）；研究组 ε2、ε3 频率明显低于对照组（χ2＝9.52、10.96，P=0.002、0.001）。详见表2。

表2 两组ApoE基因型和等位基因分布比较[例（%）]

2.2 研究组ApoE基因型与脑电图慢化年龄的关系研究组ApoE各基因型出现脑电图慢波化时的年龄：ε2型为（70.69±8.29）岁，ε3 型为（67.73±6.10）岁，ε4 型为（64.07±5.57）岁。与常见基因型 ApoE ε3 比较，ε4 基因型的脑电图慢波始发年龄明显减小（P=0.003），而ApoE ε2基因型的脑电图慢波始发年龄明显晚于其他两型（P=0.002和0.000）。

3 讨论

ApoE是血浆重要载脂蛋白之一，其在血清TC、TG及磷脂的转运和代谢中发挥作用，也是中枢神经系统胆固醇、磷脂及脂质运输的调节剂和突触发生的促进剂[8]。ApoE有3种常见的等位基因，即ε2、ε3和ε4，这3种等位基因分别编码3种ApoE蛋白异构体，其区别为112位和158位氨基酸序列的不同，ε2两位点均为半胱氨酸，ε4两位点都为精氨酸，ε3两位点分别为半胱氨酸和精氨酸。ApoE基因产生3种纯合子（ε2/2，ε3/3，ε4/4）和 3 种杂合子（ε2/3，ε2/4，ε3/4）共 6 种常见基因型[2]。个体间ApoE功能存在着一些差异，基因多态性是造成其功能差异的主要因素[9]，其中ε4可能造成胆固醇稳态、脂质转运、Aβ沉积等异常[10]。本研究结果显示，研究组血清TG浓度和血清TC浓度显著高于对照组，可能与研究组ε4的频率明显升高有关。

那么，血清脂质、TC异常是否与痴呆相关呢？有研究者认为，代谢综合征可能与认知能力下降显著相关，被认为是痴呆的危险因子，而脂质、TC异常是代谢综合征的常见表现[11]。也有作者直接研究ApoE ε4基因型与痴呆的关系，如马永兴等[12]的研究表明，ApoE ε4基因型可能与认知障碍、记忆障碍以及痴呆相关。另外，ApoE ε4基因型与老年人的寿命和认知功能相关，携带ApoE ε4等位基因的健康人，更容易患轻度认知障碍（mild cognitive impairment,MCI）[13]，众所周知，MCI是痴呆形成前的重要前期表现[14]。由此可见，ApoE ε4基因型可能通过降低ApoE胆固醇载体的功能，使体内脂质、胆固醇代谢异常，从而促进痴呆的发生。

脑电图异常是痴呆的典型表现之一[15]。痴呆患者早在脑功能表现出异常之前，脑电图已经出现慢波[16]。虽然脑电图检查是一种无创伤性、价格低廉而且在一定程度上能反映大脑的电生理变化和功能异常，但是目前尚无一种方法，能判断脑电图异常何时发生。本研究结果显示，脑电图慢波患者ApoE ε4基因型和等位基因频率明显高于对照组，且该基因型出现慢波的平均年龄明显早于ε2和ε3型。因此笔者认为，ApoE ε4基因型可能与脑电图慢化相关，携带此基因者，应在更早期密切关注脑电图的变化，有利于早期预测痴呆的发生，并适时进行早期干预，对改善预后、提高患者生活质量有重要的意义。

本研究仍存在不足，首先，研究对象数偏少，有些基因型的例数只有数例，如研究组ε2/ε2基因型只有2例。在以后的研究中，需延长研究时间以收集更多的样本，进一步确认本研究的发现。其次，研究组有些患者入组之前，其脑电图已经出现慢波，针对这种情况，本研究根据病历记载，以首次确诊慢波的时间作为慢波始发年龄，但是因就诊习惯或检查间隔的不同，个体间慢波始发年龄尚存在一定的差异性，下一步可设计队列研究进一步加以证实ApoE ε4对脑电图慢波始发年龄的影响。总之，ApoE ε4等位基因及基因型在脑电图慢波患者中频率明显升高，并具有使脑电图慢波发生年轻化的趋势，提示该基因与脑电图慢波相关。

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